.0119mg，Ca/P質量比為1.688 ;實 施例2測得結果為，lmgPLGA-CaP中鈣元素含量為0. 02374mg，磷元素含量為0. 014647mg， Ca/P質量比為1. 621 ;實施例3測得結果為，lmgPLGA-CaP中鈣元素含量為0. 0431mg，磷元 素含量為〇. 〇276mg，Ca/P質量比為1. 56。
[0059] 實施例8 :HPV疫苗佐劑劑量優(yōu)化實驗
[0060] 取實施例1制備得到的CaP-PLGA微球懸浮于lmL的pH= 5、lOmMPBS緩沖溶液中， 得到濃度分別為20mg/mL、6mg/mL和1. 6mg/mL的CaP-PLGA微球懸液；取HPV溶于lmL的pH =5、10mMPBS緩沖溶液中，得20ug/mL的HPV抗原溶液，將兩者等體積混合，吸附過夜，得 到2mL吸附有HPV抗原的CaP-PLGA懸液，即為HPV疫苗組合物。將以上制備得到的不同佐 劑含量的HPV疫苗組合物分別以每只小鼠每次注射100μL的劑量免疫BALB/c小鼠，采用 Merck公司的Gardasil鋁佐劑作為對照。免疫程序為免疫兩針，間隔四周，每只小鼠每次 注射0.lmL，第0天初免后，在第28天以相同的免疫劑量加強免疫，且初免后2周、4周，以 及加強免疫后1周采血樣檢測抗體應答水平和細胞因子水平。結果如圖7和圖8所示，結 果表明，不同微球量之間中和抗體無明顯差異，但與Merck組Gardasi1錯佐劑相比，400μg PLGA-CaP+1μgHPV組可以誘導與其相當水平的中和抗體水平；且400μgPLGA-CaP+1μg HPV組結合抗體水平顯著高于 80μgPLGA-CaP+1μgHPV組和 1000μgPLGA-CaP+1μgHPV 組，說明PLGA-CaP佐劑的優(yōu)化劑量為400μg/dose，HPV與PLGA-CaP佐劑的優(yōu)選比例為 2. 5μg/mg〇
[0061] 實施例9 :磷酸鈣與PLA聚合物的復合顆粒的制備
[0062]將100mg的PLA溶于20mL的二氯甲烷中作為油相（0)，配制lmL的0. 1M的氯化鈣 溶液作為內(nèi)水相（W1)，配制1. 0%的PVA溶液作為外水相（W2);將0. 2mL的內(nèi)水相（W1)加 入到油相（〇)中，通過均質乳化方法制備初乳W1/0,將初乳液加入到60mL的外水相中制備 預復乳液（W1/0/W2)，將此預復乳液采用快速膜乳化的方法反復壓過膜制備得到粒徑均一 的水包油包水的復乳液（W1/0/W2);然后向此復乳液中添加0.lmL的0. 05M磷酸氫二鈉溶 液，利用固化過程中內(nèi)外水相的溶質擴散使內(nèi)外溶質在乳液界面處接觸反應結晶析出，從 而制備得到CaP-PLA微球。圖9即是制備得到的PLA-CaP微球的SEM(冷場掃描電鏡）照 片，直徑約為1ym。
[0063] 實施例10 :以PLGA-CaP為佐劑，加纖維二糖，吸附HPV蛋白的抗原組合物制備
[0064] 將實施例1或2制備得到的PLGA-CaP微球懸浮于lmL的pH= 5、含lOmMPBS緩 沖溶液中，得20mg/mL的CaP-PLGA微球懸液；將纖維二糖溶于lmL的pH= 5、含lOmMPBS 緩沖溶液中，得到〇. 1M的纖維二塘；取HPV溶于lmL的pH= 5、含lOmMPBS緩沖溶液中，得 20ug/mL的HPV抗原溶液，將三者混合，吸附過夜，得到2. 5mL包含有纖維二糖且吸附HPV抗 原的PLGA-CaP懸液，即為HPV疫苗組合物。
【主權項】
1. 一種具有佐劑作用的復合顆粒，其特征在于該復合顆粒為粒徑分布在lOOnm~ 100μm之間的磷酸鈣與聚合物組成的復合顆粒，其中磷酸鈣是Ca與P摩爾比為0.1-5 : 1 的化合物或混合物；聚合物為帶負電，且zeta電位最小至_30mV的直鏈或有支鏈的聚合物、 均聚物、生物聚合物、共聚物,或其混合物；復合顆粒的zeta電位范圍是-5mV到+30mV。2. -種疫苗組合物，包含佐劑和抗原，其特征在于抗原與佐劑的比例為0. 01-80μg/ mg，所述佐劑包括如權利要求1所述的復合顆粒，所述抗原為HPV蛋白。3. 如權利要求2所述的疫苗組合物，其特征在于HPV蛋白吸附于復合顆粒表面，以粒徑 分布在lOOnm~100μm之間的納微球形式存在。4. 如權利要求3所述的疫苗組合物，其特征在于該組合物包含小分子免疫佐劑CpG、 MPLA、咪喹莫特、Polyl:C中一種或幾種的組合。5. 如權利要求3所述的疫苗組合物，其特征在于該組合物所述抗原HPV蛋白為HPVL1 蛋白、HPVL2蛋白、或HPVL1+L2蛋白。6. 如權利要求5所述的疫苗組合物，其特征在于該組合物所述HPV蛋白包括但不限于 1 ~4,6, 7,10,11，16,18, 26 ~29, 31，33, 35, 39,49, 51，52, 56, 58, 59 和 68 型之一的HPV的 VLP、五聚體或多聚體。7. 如權利要求1所述的復合顆粒的制備方法，其特征在于制備方法為A方法或B方法： A方法：用含鈣離子的水溶液為內(nèi)水相（W1)，PLGA溶于有機溶劑為油相（0)，將所述內(nèi) 水相與油相按1 : 1-50,優(yōu)選1 : 2-10體積比混合，制成油包水型（W1/0)預乳液，將此預 乳液按1 : 1-50,優(yōu)選1 : 2-10體積比加入含表面活性劑的外水相（W2)中，攪拌，制得W1/ 0/W2型預復乳液，將所述W1/0/W2型預復乳液反復通過濾膜得到尺寸均一的W1/0/W2型乳 液，將W1/0/W2型乳液固化，過程中按Ca:P摩爾為0. 1-5 : 1的比例加入包含磷酸根離子 的溶液混合，洗滌、干燥后制成PLGA-CaP復合顆粒； B方法：將PLGA溶于有機溶劑為油相（0)，含表面活性劑的溶液為外水相（W)，兩相按 1 : 1-50,優(yōu)選1 : 2-10體積比混合，制成水包油型（0/W)預乳液，將所述W/0型預乳液反 復過膜得到尺寸均一的0/W型乳液，將0/W型乳液固化，洗滌、干燥后制成PLGA顆粒，然后 先用包含鈣離子的水溶液與PLGA顆粒混合，再按Ca:P摩爾為0.1-5 : 1的比例與包含 磷酸根離子的水溶液混合，洗滌、干燥后得到PLGA-CaP復合顆粒。8. 如權利要求7所述的復合顆粒的制備方法，其特征在于制備方法中所述的鈣離子鈣 離子為羥基磷灰石、無定型磷酸鈣、磷酸三鈣、磷酸八鈣、磷酸氫鈣、四水合硝酸鈣或氯化鈣 等可溶性鈣鹽，或者為它們的混合物。9. 如權利要求7所述的復合顆粒的制備方法，其特征在于制備方法中所述的磷酸根離 子為磷酸氫二銨，磷酸氫二鉀，磷酸氫二鈉和正磷酸中之一或其混合物。10. 如權利要求7所述的復合顆粒的制備方法，其特征在于制備方法中所述的油相為 為乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷或上述至少兩種以上的混合物。11. 如權利要求7所述的復合顆粒的制備方法，其特征在于制備方法中所述的含有表 面活性劑的外水相（W2或W)為含有0. 001-10%的PVA水溶液，其醇解度為87~90%，聚 合鏈節(jié)數(shù)為1700-1750 ;或為含有0. 001-10 %的PVA-PEG混合水溶液，PVA與PEG的質量百 分比為 20-80 : 30-90。12. 如權利要求7所述的復合顆粒的制備方法，其特征在于制備方法中所述的混合方 法包括但不限于通過均質、超聲或攪拌方式。13. 如權利要求2、3、4、5或6所述的一種疫苗組合物的制備方法，其特征在于該方法為 將復合顆粒作為佐劑溶于緩沖液體系，HPV蛋白作為抗原溶于緩沖液體系，將兩緩沖液體系 混合，配制成含有HPV抗原的微球懸液，制得HPV疫苗組合物。14. 如權利要求13所述的一種疫苗組合物的制備方法，其特征在于該方法緩沖液體系 為磷酸、硼酸、Tris、HEPES或MOPS緩沖液，pH值范圍4-10。15. 如權利要求2、3、4、5或6所述的疫苗組合物在制備治療或預防HPV病毒感染藥物 中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種關于HPV病毒的新型佐劑疫苗，及該疫苗的制備方法。具體而言，本發(fā)明的新型佐劑為PLGA-CaP復合顆粒，該佐劑疫苗PLGA-CaP復合顆粒能夠對體內(nèi)免疫產(chǎn)生應答，屬于開發(fā)高效的HPV蛋白疫苗組合物。
【IPC分類】A61P31/20, A61K47/04, A61K39/39, A61K47/34, A61K39/12
【公開號】CN105363029
【申請?zhí)枴緾N201410393066
【發(fā)明人】楊小杰, 張世艷
【申請人】張世艷, 楊小杰
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年8月12日