后3周，鼓膜穿孔 被上皮完全閉合。E.在治療后6周，該上皮稍微變薄，變得更像鼓膜。F.在治療后12周， 該上皮變得進(jìn)一步像正常的鼓膜。
[0035][圖2]顯示使用本發(fā)明耳道再生試劑的耳道再生治療的實(shí)例的圖。A.指出除去了 膽脂瘤的傷口中的軟組織缺陷與骨露出。B.將明膠海綿物質(zhì)浸潰bFGF，并留置bFGF明膠 海綿W使該傷口被完全被覆。C.用海藻酸或其鹽(或纖維蛋白膠）固定該海綿物質(zhì)?；?治療后2周，除去殘留于表面的海藻酸或其鹽等；證實(shí)傷口已完全閉合，且W幾乎與正常組 織相同的狀態(tài)實(shí)現(xiàn)了再生。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 用于本發(fā)明鼓膜/耳道再生試劑中的生長(zhǎng)因子bFGF對(duì)細(xì)胞具有直接增殖作用和 新血管形成能力。鼓膜具有Ξ層結(jié)構(gòu)；為了保證充分發(fā)揮基本的聲音傳導(dǎo)功能，重要的是維 持該Ξ層結(jié)構(gòu)。然而，鼓膜破損和自發(fā)修復(fù)的情形經(jīng)常發(fā)生，其中，鼓膜薄且只有上皮層再 生而Ξ層結(jié)構(gòu)未被維持。
[0037] 對(duì)于其再生，作為支架的成纖維細(xì)胞增殖與維持足W支持Ξ層結(jié)構(gòu)的血流都是必 不可少的。從該觀點(diǎn)出發(fā)，bFGF具有理想的特性。具體地，如其命名所示，bFGF具有刺激 成纖維細(xì)胞增殖的直接作用，并且還具有誘導(dǎo)血管并供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物至周?chē)M織的作用。
[0038] 作為本發(fā)明中的bFGF,可W使用其同源物。本發(fā)明中的bFGF和/或其同源物是作 為天然產(chǎn)品，或者通過(guò)使用微生物或培養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)基因重組技術(shù)分離和純化的，或通過(guò)對(duì) 其進(jìn)行化學(xué)修飾或者生物修飾獲得的。作為本發(fā)明中使用的bFGF,特別優(yōu)選人bFGF或其同 源物。
[0039]bFGF的同源物是指W下多膚山或山]。
[0040] [I]由與哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的bFGF基本相同的氨基酸序列構(gòu)成的多膚。運(yùn)里"基本 相同的氨基酸序列"是指1-6個(gè)氨基酸被其它種類(lèi)的氨基酸置換，并且具有bFGF的生物活 性的氨基酸序列。[II]其中附加氨基酸片斷被附加至哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生的bFGF的N-末端和 /或C-末端，或附加至上述多膚[I]的N-末端和/或C-末端的多膚。附加氨基酸片斷是 指由1- 12個(gè)氨基酸構(gòu)成，且不影響bFGF的生物活性或上述多膚[I]的生物活性的片斷。
[0041] 人bFGF是146個(gè)氨基酸的多膚；在本發(fā)明的制備中，作為人bFGF的同源物（上述 同源物山），例如，可W使用日本特表平2-504468中記載的146個(gè)氨基酸的多膚。該多膚 中，構(gòu)成人bFGF的氨基酸序列的69位半脫氨酸（切S)和87位半脫氨酸（切S)被絲氨酸（ Ser)置換。
[0042]作為上述同源物[II]，例如可W使用日本特表昭63-500843中公開(kāi)的155個(gè)的多 膚。該多膚中，9個(gè)氨基酸的片斷被添加至人bFGF的N-末端。
[0043] 同時(shí)，可W使用日本特表昭63 - 501953中公開(kāi)的Met-被添加至N-末端的147個(gè) 氨基酸的多膚，W及11個(gè)氨基酸構(gòu)成的片斷被添加至N-末端的157個(gè)氨基酸的多膚。
[0044] 特別優(yōu)選的bFGF是曲弗明（基因重組）。 W45] 在本發(fā)明的制備中，可W單獨(dú)使用一種bFGF,或者可W組合使用多種。此外，如上 所述，存在多種bFGF的同源物，并且運(yùn)些同源物可W單獨(dú)使用或者組合使用。
[0046] 因?yàn)樵诨钌矬w內(nèi)bFGF的豐度非常低，因此為了商業(yè)上穩(wěn)定供應(yīng)本發(fā)明的制劑， 特別優(yōu)選使用通過(guò)基因重組技術(shù)、利用微生物如大腸桿菌或培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的bFGF或其同 源物。當(dāng)用于產(chǎn)生bFGF或其同源物的基因（在該情況下，通常為上述多膚（I))被插入到微 生物或培養(yǎng)細(xì)胞中，由該微生物或培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的產(chǎn)品通常為具有添加至bFGF的N-末端 和/或C-末端、或者添加至上述多膚[I]的N-末端和/或C-末端的附加氨基酸片斷的， 即上述多膚[II]。
[0047]用作本發(fā)明中明膠海綿的原材料的明膠的選擇不受特別限制；可W使用任何通常 可使用的。例如，可W提及通過(guò)用酸或堿處理牛、豬、雞、娃魚(yú)等的骨、初帶、腫或皮膚，用水 加熱萃取獲得的粗膠原蛋白等。不僅可W使用一種明膠，還可適當(dāng)?shù)墓不煳锸褂镁哂?不同材料和不同物理性質(zhì)如溶解性、分子量和等電點(diǎn)的明膠。
[0048] 用于本發(fā)明中的明膠海綿可被交聯(lián)W提高其耐水性，W便使之用作支架用于再生 組織W足W閉合鼓膜或耳道中的缺陷的時(shí)期，只要其不喪失能夠完全被覆形狀復(fù)雜的鼓膜 穿孔邊緣和耳道缺陷的邊緣的柔軟性。交聯(lián)的方法不受特別限制；實(shí)例包括設(shè)及使用交聯(lián) 劑、真空熱脫水、干燥加熱、丫-射線(xiàn)福照、紫外線(xiàn)福照、電子射線(xiàn)福照、X射線(xiàn)福照等的方 法。
[0049] 本發(fā)明的明膠海綿具有許多細(xì)孔，并且提供比膠原蛋白更高的自由度。通過(guò)具有 大量細(xì)孔，當(dāng)用作支架材料時(shí)，明膠海綿使得周?chē)?xì)胞容易進(jìn)入海綿，使得可WW良好的方 式再生鼓膜和耳道。運(yùn)與使用片狀支架材料制備的常規(guī)再生試劑明顯不同。具體地，對(duì)于 如片狀膠原蛋白膜的支架，組織不會(huì)在支架中前進(jìn)時(shí)將自身再生，而是會(huì)向上或向下地將 自身再生。運(yùn)不能完全被覆大于一定尺寸的鼓膜缺陷的缺陷部分，因此不能修復(fù)鼓膜，或出 現(xiàn)與周?chē)M織的粘連并留下后遺癥。
[0050] 考慮到細(xì)胞容易進(jìn)入海綿而確保良好的細(xì)胞粘附的事實(shí)，優(yōu)選本發(fā)明的明膠海綿 的細(xì)孔平均孔徑為大約10微米或更大，為防止低細(xì)胞密度所致的鼓膜或耳道再生速率的 降低，優(yōu)選平均直徑為約500微米或更小。更優(yōu)選的范圍為約100 -約400微米。
[0051] 本發(fā)明的明膠海綿可化含有其他生物可吸收高分子材料，只要其功能不受負(fù)面影 響。運(yùn)類(lèi)生物可吸收高分子材料例如包括：合成高分子，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚-ε-己內(nèi) 醋、乳酸-乙醇酸共聚物、乙醇酸-ε-己內(nèi)醋共聚物、乳酸-ε-己內(nèi)醋共聚物、聚巧樣酸、 聚蘋(píng)果酸、聚-曰-氯基丙締酸醋、聚-0-?基酸、聚乙二酸立亞甲基醋、聚乙二酸四亞甲基 醋、聚-鄰-醋、聚-鄰-碳酸醋、聚碳酸亞乙醋、聚-丫-苯甲基-心谷氨酸醋、聚-丫-甲 基-k谷氨酸醋和聚k丙氨酸；天然高分子，如多糖比如淀粉、海藻酸、透明質(zhì)酸、幾下質(zhì)、 果膠酸和它們的衍生物；W及蛋白質(zhì)比如明膠、膠原、白蛋白、和纖維蛋白等。
[0052] 本發(fā)明的明膠海綿可W通過(guò)例如下列制備：利用均化器W大約3000-大約 lOOOOrpm的轉(zhuǎn)速將明膠水溶液攬拌并起泡大約10秒至大約5分鐘，然后將明膠水溶液誘 注至適當(dāng)大小的模具中，并在大約-40至大約-80°C下冷凍大約30-大約120分鐘，之后，在 例如大約0. 1托的條件下冷凍干燥該冷凍物質(zhì)。如果明膠水溶液的濃度過(guò)高，則獲得的明 膠海綿的柔軟度降低，因此優(yōu)選將濃度調(diào)節(jié)至例如大約3w/w%或更少。如果需要進(jìn)一步交 聯(lián)，則可W酌情施行交聯(lián)。
[0053] 作為本發(fā)明的明膠海綿，可W使用市售的止血?jiǎng)ɡ鏢pongel(注冊(cè)商標(biāo)） (AstellasF^harma)、Gelfoam(注冊(cè)商標(biāo)）（Pharmacia&Upjohn)等）。
[0054] 本發(fā)明的明膠海綿的形狀和大小不受特別限制，只要足夠大至被覆病人鼓膜或者 耳道的缺陷部分。
[0055] 使運(yùn)樣制備的明膠海綿載有bFGF的方法不受特別限定，例如可W將bFGF的水 溶液逐滴添加至明膠海綿，或者可W通過(guò)添加bFGF的水溶液使明膠海綿膨脹。
[0056] 明膠海綿載有bFGF的量不受特別限定，只要它的量足W再生鼓膜或者耳道，例如 其可W是每個(gè)給藥位置大約0.1-大約ιοοομκ，優(yōu)選大約1-大約looμg。
[0057] 運(yùn)樣獲得的載有bFGF的明膠海綿制品還可W被冷凍干燥。如果需要，可W通過(guò)例 如在液氮中冷凍制品30分鐘或更久，或者在-80°C下冷凍制品1小時(shí)或更久，然后利用冷凍 干燥設(shè)備干燥所述制品1-3天來(lái)進(jìn)行冷凍干燥。
[0058] 本發(fā)明的鼓膜/耳道再生試劑適用于所有情況，只要病人的鼓膜穿孔或者耳道缺 陷不伴隨中耳/外耳的活動(dòng)性感染/炎癥。例如，鼓膜穿孔的情形包括慢性中耳炎，鼓膜閉 合外科手術(shù)或者鼓室成形術(shù)之后再穿孔，陳舊外傷鼓膜穿孔，滲出性中耳炎的鼓膜切開(kāi)或 鼓膜管留置后的穿孔殘留等。耳道軟組織缺陷的癥例包括在耳道膽脂瘤切除、鼓室成形術(shù) 或者耳道腫瘤切除之后具有耳道軟組織缺陷和耳道骨露出的那些。
[0059] 本發(fā)明的鼓膜/耳道再生試劑可特別優(yōu)選用于利用常規(guī)再生醫(yī)學(xué)技術(shù)的療法不 適用的、患有大的鼓膜穿孔或耳道軟組織缺陷的患者。特別地，對(duì)于鼓膜的大于1/3特別 是大于2/3是缺陷的患有鼓膜穿孔的患者，鼓膜修復(fù)是可能的。對(duì)于患有最大直徑為1cm 或更大、特別是2cm或更大的耳道軟組織缺陷的患者，耳道修復(fù)是可能的。
[0060] 將載有bFGF的明膠海綿調(diào)節(jié)至比鼓膜或耳道缺陷部分大的尺寸，并W被覆整個(gè) 缺陷部分的方式留置。運(yùn)里，在缺陷部分的老舊邊緣情形中，期望該邊緣被新鮮化W促進(jìn)組 織再生。新鮮化的方法包括，例如，通過(guò)利用手術(shù)刀等磨傷邊緣，或通過(guò)利用具有蛋白質(zhì)變 性效果的藥物如乙酸侶或高濃度局部麻醉劑的處理來(lái)除去邊緣的上皮的方法。
[0061] 該基于藥物的方法在耳道形狀狹窄造成鼓膜穿孔的邊緣難W新鮮化的情形中特 別有效；首先，將含有乙酸侶的明膠海綿留置于缺陷部分，并在大約30分鐘后將其除去。之 后，用4%鹽酸利多卡因進(jìn)行麻醉，之后將邊緣的變性組織(變色為白色）最大可能程度地除 去，由此實(shí)現(xiàn)新鮮化。