a獲得細(xì)菌制備物，它們已經(jīng)被制備成適于添加入食品如嬰幼兒配方食品 的形式?？梢酝ㄟ^干混合將該細(xì)菌制備物加入到粉末狀嬰幼兒配方食品中。
[0072] 可以在該方法的任意階段加入乳鐵蛋白，但是優(yōu)選在加熱步驟后加入。
[0073] 組合物包含蛋白質(zhì)源，其可以以1.4至10(^/1001^31、優(yōu)選1.4至6.(^/1001^31組 合物的范圍存在。由于乳鐵蛋白是蛋白質(zhì)，所以它應(yīng)當(dāng)被視為是蛋白質(zhì)源的一部分。
[0074] 已知乳清蛋白提供了多種健康益處。例如，它易于消化。乳清中的蛋白質(zhì)級分(在 乳清內(nèi)總干燥固體的約10%)包含數(shù)種蛋白質(zhì)級分，例如乳球蛋白、乳清蛋白、牛血清 清蛋白和免疫球蛋白。在一項實施方案中，至少50%、優(yōu)選至少75%、甚至更優(yōu)選至少85% 重量的蛋白質(zhì)源是乳清蛋白。
[0075] 如果存在脂質(zhì)源，其可以構(gòu)成組合物總能量的30至55%。碳水化合物源可以構(gòu)成 組合物總能量的35至65%。
[0076] 還可以將唾液酸加入到本發(fā)明的組合物中。唾液酸是神經(jīng)氨酸（一種具有9-碳骨 架的單糖)的N-或0-取代的衍生物的通用術(shù)語。
[0077] 任意唾液酸可用于本發(fā)明的目的。但是，如果唾液酸具有下式結(jié)構(gòu)則是優(yōu)選的：
[0079] Rl = H、乙酰基、乳?；⒓谆?、硫酸酯基、磷酸酯基、脫水唾液酸、巖藻糖、葡萄糖或 半乳糖
[0080] R2 = N-乙?；?、N-羥乙?；被?、羥基、N-羥乙酰基-0-乙?；騈-羥乙酰基-0-甲基
[00811 R3 = H、半乳糖、N-乙?；咸前?、N-乙?；肴樘前?、唾液酸或N-羥乙?；窠?jīng)氨 酸
[0082] Rl可以選自H、乙酰基、乳?；?、甲基、硫酸酯基、磷酸酯基、脫水唾液酸、巖藻糖、葡 萄糖和/或半乳糖。
[0083] R2可以選自N-乙酰基、N-羥乙酰基、氨基、羥基、N-羥乙?；?0-乙酰基和/或N-羥 乙?；?0-甲基。
[0084] R3可以選自H、半乳糖、N-乙?；咸前?、N-乙?；肴樘前?、唾液酸和/或N-羥乙 ?；窠?jīng)氨酸。
[0085] Rl位上的基團(tuán)可以彼此相同或不同。
[0086] 例如，唾液酸可以是其中R1 = H、R2 = N-乙?；蚏3 = H的N-乙?；窠?jīng)氨酸。根據(jù) 本發(fā)明的另一項實施方案，唾液酸可以選自2-酮基-5-乙酰氨基-3，5-雙脫氧-d-甘油-d-半 乳糖-nonulosonic acid(Neu5Ac)和η-輕乙酰基神經(jīng)氨酸或其混合物。
[0087]如本發(fā)明所用的唾液酸包括N-乙酰基神經(jīng)氨酸，其具有以下同義詞和縮寫：〇-唾 液酸;5-乙酰氨基-3，5-雙脫氧-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulosonic acid; 5-乙酰氨基-3，5-雙脫氧-D-甘油-D-半乳糖-nulosonic acid;醋紐拉酸;N-乙?；?神經(jīng)氨酸鹽/酯;N-乙酰 基神經(jīng)氨酸;NANA和Neu5Ac。
[0088]本發(fā)明擴(kuò)展至乳鐵蛋白在制備用于治療或預(yù)防腦發(fā)育遲緩和/或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲 緩的組合物中的用途。
[0089] 就本發(fā)明的用途而言，重要的是，組合物含有乳鐵蛋白或在消耗后產(chǎn)生乳鐵蛋白 的化合物。該組合物不是必須富含乳鐵蛋白，雖然這可以是優(yōu)選的，因為通過這種方式可以 以較小的體積施用較多的乳鐵蛋白。
[0090] 乳鐵蛋白可用于制備任意類型的組合物。然而優(yōu)選的是，將乳鐵蛋白作為按照上 文所述那樣的組合物被提供。
[0091] 在本發(fā)明的一項實施方案中，含有乳鐵蛋白的組合物可用于治療或預(yù)防視覺發(fā)育 遲緩。
[0092] 在本發(fā)明的另一項實施方案中，含有乳鐵蛋白的組合物可用于治療或預(yù)防神經(jīng)移 行遲緩。
[0093] 在本發(fā)明的另一項實施方案中，含有乳鐵蛋白的組合物可用于治療或預(yù)防認(rèn)知發(fā) 育遲緩。
[0094] 本發(fā)明的組合物可用于增加神經(jīng)元密度和或神經(jīng)元存活。
[0095] 本發(fā)明的組合物還可用于治療或預(yù)防學(xué)習(xí)能力受損、精神行為 (mentalperformance)受損或注意廣度降低。
[0096] 為了達(dá)到該目的，可以將組合物施用于處于妊娠中的母親、處于泌乳中的母親、早 產(chǎn)或如期出生的嬰兒、極低/低出生體重嬰幼兒、IUGR嬰幼兒、嬰幼兒、幼兒、兒童和/或青少 年。
[0097] 雖然本發(fā)明的組合物通常可用于在任意年齡組的嬰幼兒中治療或預(yù)防腦障礙和/ 或修復(fù)和/或逆轉(zhuǎn)腦損傷，但是發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的組合物特別有助于在IUGR嬰幼兒中治療或預(yù) 防腦障礙和/或修復(fù)和/或逆轉(zhuǎn)腦損傷。
[0098] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，他們可以自由地組合本文所述的本發(fā)明的所有特征而不 背離所公開的本發(fā)明的范圍。特別地，對本發(fā)明的用途所述的特征可以適用于本發(fā)明的組 合物，反之亦然。
[0099]本發(fā)明的其它優(yōu)點和特征從如下實施例和附圖中是顯而易見的。
【附圖說明】
[0100]圖1顯示了在基礎(chǔ)條件(未經(jīng)處理的細(xì)胞)下和用神經(jīng)營養(yǎng)因子CNTF(100ng/mL，陽 性對照）或不同濃度的富含乳鐵蛋白的牛乳級分處理細(xì)胞后軸突外生的陽性NS20Y細(xì)胞的 百分比。數(shù)據(jù)為平均值土 SEM，根據(jù)各組η = 3至7(基礎(chǔ)，n = 7; CNTF,n = 3; lug/L,n = 3; IOug/ L，n = 7;100ug/L，n = 3;lmg/L，n = 3; 10mg/L，η = 5 ; 100mg/L，n = 7;lg/L，n = 6)〇 米用 Student t檢驗將數(shù)據(jù)與未經(jīng)處理的基礎(chǔ)組進(jìn)行比較。當(dāng)P〈0.05時差異被視為顯著。
[0101]圖2顯示了在H2O2攻擊和用牛乳乳鐵蛋白保護(hù)后腸神經(jīng)元原代培養(yǎng)物釋放的神經(jīng) 元特異性稀醇化酶(NSE)，NSE是神經(jīng)元細(xì)胞死亡的標(biāo)記物。數(shù)據(jù)為平均值土 0.05時差異被視為顯著。
[0102]圖3顯示了在有或無0.001至lg/L的不同濃度的牛乳乳鐵蛋白的存在下用H2O2攻擊 后所培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞中7-AAD陽性細(xì)胞的百分比。
[0103] 圖4a顯示了在Pl時正常和IUGR嬰幼兒的腦與體重之比。在正常嬰幼兒和甚至更多 地在IUGR嬰幼兒中均發(fā)現(xiàn)腦與體重之比在妊娠期間施用乳鐵蛋白后增加。
[0104] 圖4b顯示了在P7時正常和IUGR嬰幼兒的腦與體重之比。在正常嬰幼兒和甚至更多 地在IUGR嬰幼兒中均發(fā)現(xiàn)腦與體重之比在施用乳鐵蛋白后增加。
[0105] 圖5顯示了在P7時指示腦活動和發(fā)育的數(shù)種代謝標(biāo)記物在正常嬰幼兒、IUGR嬰幼 兒和用乳鐵蛋白處理的IUGR嬰幼兒的海馬區(qū)中的存在。海馬區(qū)活動與學(xué)習(xí)和短時記憶相 關(guān)。
[0106] 圖6顯示了在P7時指示腦活動和發(fā)育的數(shù)種代謝標(biāo)記物在正常嬰幼兒、IUGR嬰幼 兒和用乳鐵蛋白處理的IUGR嬰幼兒的皮質(zhì)中的存在。皮質(zhì)活動與長時記憶相關(guān)。
[0107] 圖7顯示了DAPI染色后海馬區(qū)CA2-CA3視野中的核形態(tài)。
[0108]圖8顯示膳食乳鐵蛋白補(bǔ)充顯著增加了在出生后第7天的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF)的基因表達(dá)。
[0109]圖9顯示了4.5月齡大鼠的自由適應(yīng)性試驗結(jié)果。對照-媒介物和bLf-媒介物的η = 10，對照-dex的η = 7，bLf_Dex的η = 14，一個參數(shù):探訪。
【具體實施方式】 [0110] 實施例：
[0111]富含乳鐵蛋白的牛乳級分的生物活性對體外促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞存活和軸突外生具 有作用。
[0112] 軸突外生過程包括軸突從神經(jīng)元向外生長，它是神經(jīng)元發(fā)育的一部分。采用充分 建立的和常用的體外生物測定法測定了富含乳鐵蛋白的牛乳級分對軸突外生的影響。
[0113] 簡言之，融化來自低溫存儲器的NS20Y鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞(DSMZ)，以約27 X IO3 個細(xì)胞/cm2的密度鋪在組織培養(yǎng)物處理的燒瓶(Falcon)中，在含有10%FCS(Gibco)和2mM L-谷氨酰胺(Gibco)的DMEM(Gibco)的存在下擴(kuò)展。鋪板2天后，通過機(jī)械攪拌(輕敲燒瓶)從 燒瓶中分離出細(xì)胞，通過使混懸液數(shù)次通過火焰精制的玻璃吸管得到單一細(xì)胞混懸液。然 后將細(xì)胞在含有10%FCS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM的存在下、以2,000個細(xì)胞/蓋玻片的密 度鋪在13mm圓形玻璃蓋玻片上。第二天，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換成含有0.5%FCS、2mM L-谷氨酰胺和 待測試的不同濃度的乳級分的DMEM。一天后，將細(xì)胞用4%低聚甲醛固定，將蓋玻片固定在 載玻片上。
[0114] 采用Axioplan 2顯微鏡(Zeiss)對所有蓋玻片進(jìn)行成像。從25個穿過蓋玻片直徑 的確定視野取數(shù)字圖像(20X物鏡，Axiocam MRc，Zeiss)。從處于蓋玻片邊緣的第一個視野 開始穿過蓋玻片對細(xì)胞系統(tǒng)地進(jìn)行計數(shù)，直到已經(jīng)計數(shù)了 100個細(xì)胞。針對軸突外生陽性或 陰性對細(xì)胞進(jìn)行評分。如果由細(xì)胞體發(fā)出的類似軸突的突出物達(dá)到比細(xì)胞體長的長度，則 視為軸突外生陽性細(xì)胞。
[0115] 采用student t檢驗對比了一個對照參比群體的平均值和各組中來自所有其它處 理的平均值的差異。
[0116] 測試了下列濃度的富含乳鐵蛋白的牛乳級分：lyg/L、10yg/L、100yg/L、lmg/L、 10mg/L、100mg/L和lg/L。進(jìn)行了陽性對照（CNTF，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子，100ng/mL)，它是以前 被報道促進(jìn)不同神經(jīng)元群體軸突外生的熟知的神經(jīng)營養(yǎng)因子（Oyesiku和Wigston，1996 (Oyesiku NM,Wigston DJ:Ciliary neurotrophic factor stimulates neunte outgrowth from spinal cord neu-rons.J Comp Neurol 1996;364:68-77·))。基礎(chǔ)對照 組由未經(jīng)處理的細(xì)胞組成。結(jié)果示于圖I中。
[0117] 保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞對抗應(yīng)激
[0118] 將大鼠腸神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng)物接種入各孔，與不同濃度的富含牛乳鐵蛋白的級 分一起溫育48小時。用磷酸鹽緩沖鹽水(無菌PBS，37°C)洗滌3次后，將細(xì)胞在不含乳鐵蛋白 且含有H 2O2或其媒介物(對照）的細(xì)胞培養(yǎng)基中溫育12小時。通過測定細(xì)胞培養(yǎng)基中神經(jīng)元 特異性烯醇化酶(NSE)的釋放評價了乳鐵蛋白對H 2O2-誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡的保護(hù)作用。 在氧化性應(yīng)激后，收集不同組的培