19:331-338)。
[0149] 乳鐵蛋白改善神經(jīng)元密度和神經(jīng)元存活，能夠修復(fù)和/或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元細(xì)胞損傷。
[0150] 在MR獲取后進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查。收集在紋狀體、背海馬區(qū)和側(cè)海馬區(qū)水平上的連續(xù) 切片以評價皮質(zhì)和海馬區(qū)結(jié)構(gòu)和白質(zhì)損傷。采用免疫組織化學(xué)標(biāo)記特定的細(xì)胞類型，目的 是確定特定的細(xì)胞響應(yīng)。對神經(jīng)元（NeuN)、星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP)和放射狀神經(jīng)膠質(zhì) (Nestin)以及白質(zhì)髓鞘形成的標(biāo)記物(MBP)進(jìn)行特異性標(biāo)記。簡要方法如下：
[0151] 分別在P7和P21時，用氯胺酮使各組的幼仔深度麻醉(50mg/ml ;0.2-0.5ml，i .p.)。 給動物經(jīng)賁門內(nèi)灌注0.9%NaCl，然后灌注4%低聚甲醛。取出腦，稱重，在4%低聚甲醛中進(jìn) 行后固定過夜，然后在30 %蔗糖中進(jìn)行后固定最少24小時，于-80°C貯存至切片。在低溫恒 溫器(MicromCryo-Star HM 560M,Microm International,德國）上切下在背海馬區(qū)水平上 的冠狀切片（IOym)。從每只動物中采集200μπι間隔的3個切片。
[0152] 免疫組織化學(xué)：采用抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶復(fù)合物（ABC; Vector Laboratories，Burl ingame，CA，USA)對腦組織進(jìn)行處理用于MBP (1: 400brand ci ty country)的免疫反應(yīng)性。將切片在4%牛血清清蛋白（BSA brand city country)中封閉，然 后與初級抗體一起于4°C溫育24小時，此后將它們與二級抗體（l:200brand city country) 一起溫育，然后與抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物（I : 200 ,Vector Laboratories， Burlingame,CA,USA) -起溫育。使切片與發(fā)色團(tuán)3,3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB brand city country)在0.01 %過氧化氫中反應(yīng)，然后覆蓋蓋玻片。
[0153] 相同方案用于Nestin(l:500brand city country)、GFAP(l:400brand city country)和NeuN( 1: 200brand ci ty country)的焚光免疫組織化學(xué)，不同的是切片不在抗 生物素蛋白-生物素復(fù)合物和DAB中溫育。
[0154] 同時對各實驗組及其相應(yīng)的對照組進(jìn)行染色。當(dāng)省略初級抗體處理時，染色不能 發(fā)生。
[0155] 采用MetaMorph? 成像系 統(tǒng)(Meta Imaging Software,Molecular Devices Corporation，賓夕法尼亞，U. S. A)進(jìn)行定量分析。匯集每只動物的值，計算每組的平均值土 SEM的平均值。用不公開的代碼對針對觀察者設(shè)盲的編碼載玻片進(jìn)行了測定，直到得出分析 結(jié)論。
[0156] 結(jié)果如下并如圖7所示。
[0157] 組織學(xué)分析揭示：在P7時，LF補(bǔ)充Dex幼仔(n = 5)與Dex對照幼仔相比顯著增加了 海馬區(qū)CA2-CA3視野中的核形態(tài)和神經(jīng)元密度。在P7時皮質(zhì)中的神經(jīng)元密度減小啟示了神 經(jīng)元損失。神經(jīng)元密度與正常對照媒介物組相似(圖7)。在這種特定的發(fā)育時間框中給予的 乳鐵蛋白將影響海馬區(qū)和極易因營養(yǎng)不良和與異常相關(guān)的應(yīng)激而受損的區(qū)域中的神經(jīng)元 密度。這意味著LF施用增加了神經(jīng)元存活和神經(jīng)元保護(hù)，例如在年幼IUGR大鼠中。
[0158] 乳鐵蛋白補(bǔ)充增加了腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的基因表達(dá)。
[0159]圖8顯示：膳食乳鐵蛋白補(bǔ)充顯著增加了在出生后第7天的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF)的基因表達(dá)。
[0160] BDNF是促進(jìn)周圍神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)中神經(jīng)元分化、存活和可塑性的 神經(jīng)營養(yǎng)因子。它是在多個神經(jīng)元發(fā)育方面和成熟神經(jīng)元中有牽連的關(guān)鍵分子。在CNS中， BDNF引起長時程增強(qiáng)，后者與突觸可塑性相關(guān)。BDNF促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。具體而言，BDNF促進(jìn)軸 突外生和增加突觸蛋白質(zhì)的表達(dá)，它們是建立發(fā)育過程中突觸聯(lián)接或功能所需的。因此，膳 食乳鐵蛋白具有神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)保護(hù)的作用。
[0161] 基因表達(dá)是基因編碼的信息通過其轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的過程。我們的研究是用充分建 立的方法分析乳鐵蛋白補(bǔ)充對基因組分析腦BDNF水平的作用的首次研究。
[0162] 簡言之，用RNeasy Mini Kit??按照制造商的方案(Qiagen,巴塞爾，瑞士）從海馬 區(qū)中提取總RNA。采用800個單位的莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen，巴塞爾，瑞 士）、在0.3個單位/微升1?嫩8；[11(?1'011^3(]〇印，麥迪遜，￥1)、7.5以1隨機(jī)引物（寡（(11'〇6)、 1.2mM dNTP和12μΜ DTT的存在下使2.5微克總1?祖進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。通過定量實時?0?、采用八81 step one plus Detection System(Applera Europe ,Rotkreuz，瑞士）測定大鼠 BDNF的 cDNAs表達(dá)，并采用管家核糖體基因36B4使其標(biāo)準(zhǔn)化。采用SYBR Green Core Reagent試劑 盒(Applera Europe ,Rotkreuz，瑞士)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量，結(jié)果以相對于對照組值的任意 單位(A.U)表示。采用Primer Express軟件(Applera Europe,Rotkreuz，瑞士）設(shè)計引物。
[0163] 動物行為數(shù)據(jù)：
[0164] 在妊娠和泌乳的整個過程(總計6周）中將牛乳乳鐵蛋白（bLF)以lg/kg/天的劑量 水平補(bǔ)充給大鼠母親，以便在4.5月齡時在4個不同的組：（1)對照-媒介物(CE); (2)對照-DEX(CD); (3)乳鐵蛋白-媒介物(LE);和(4)乳鐵蛋白-Dex(LD)中采用Intellicage測定bLF 對動物行為的益處。
[0165] 自由適應(yīng)性試驗(與曠場試驗相關(guān))是將大鼠放入新環(huán)境Inte11 icage中達(dá)3天，以 監(jiān)測大鼠的活動和與環(huán)境的相互影響（不同角落的探訪數(shù)）。對探究行為/好奇心進(jìn)行了監(jiān) 測以分析大鼠是如何適應(yīng)新環(huán)境的。
[0166] 結(jié)果顯示：在3天試驗的整個過程中，與對照-媒介物（正常對照）、bLF_媒介物和 bLF-DEX大鼠相比，對照DEX大鼠具有降低的對Intel I icase的探究活動/好奇心。在自由適 應(yīng)性試驗的第3天，對照-Dex與對照-媒介物和bLf-Dex二者之間的差異是顯著的(P〈0.05)。 這些結(jié)果啟示:在出生前補(bǔ)充LF改善了焦慮樣行為，包括對于4.5月齡的健康和生命早期腦 損傷成年動物而言更多的探究活動、好奇心和與新環(huán)境的相互影響（圖9)。所得數(shù)據(jù)啟示了 LF具有顯著的神經(jīng)元保護(hù)作用和一定程度上較小的對神經(jīng)發(fā)育的作用（圖1)。
【主權(quán)項】
1. 乳鐵蛋白在制備用于預(yù)防腦發(fā)育遲緩和/或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩的可攝入組合物中的 用途，所述組合物包含濃度為0.01g-1 〇〇g/1OOkca1組合物的乳鐵蛋白。2. 乳鐵蛋白在制備用于預(yù)防神經(jīng)移行遲緩和/或認(rèn)識發(fā)育遲緩的可攝入組合物中的用 途，所述組合物包含濃度為0.01g-1 〇〇g/1OOkca1組合物的乳鐵蛋白。3. 乳鐵蛋白在制備用于預(yù)防學(xué)習(xí)能力受損、精神行為受損、記憶力受損或注意廣度降 低的可攝入組合物中的用途，所述組合物包含濃度為〇.〇lg-l〇〇g/l〇〇kcal組合物的乳鐵蛋 白。4. 權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中該組合物選自食品、藥物組合物、營養(yǎng)配制物、營養(yǎng) 保健品、食品添加劑。5. 權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中該組合物選自動物食品。6. 權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中該組合物選自飲料。7. 權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中該組合物選自嬰幼兒喂養(yǎng)配方食品。8. 權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中乳鐵蛋白作為富含乳鐵蛋白的乳或乳清級分被提 供。9. 權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中所述組合物包含蛋白質(zhì)源、脂質(zhì)源和碳水化合物 源。10. 權(quán)利要求9的用途，其中蛋白質(zhì)源以1.4至4.Og/lOOkcal組合物的量存在。11. 權(quán)利要求9的用途，其中50%重量以上的蛋白質(zhì)源是乳清蛋白。12. 權(quán)利要求9的用途，其中脂質(zhì)源構(gòu)成組合物總能量的30至55%和/或碳水化合物源 構(gòu)成組合物總能量的35至65%。13. 權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中所述組合物還包含至少70mg/L的總唾液酸、以總 脂肪酸重量計至少〇. 1 %的ω-3脂肪酸和/或以總脂肪酸重量計至少0.25%ω-6脂肪酸。14. 權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中組合物意欲以相當(dāng)于攝入至少O.Olg乳鐵蛋白/kg 體重/天的量施用。15. 權(quán)利要求1-3任一項的用途，其中組合物被施用于處于妊娠中的母親、處于泌乳中 的母親、早產(chǎn)或如期出生的嬰兒、低出生體重嬰幼兒、IUGR嬰幼兒、嬰幼兒、幼兒、兒童和/或 青少年。16. 乳鐵蛋白在制備用于預(yù)防腦發(fā)育遲緩和/或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩的組合物中的用途。17. 乳鐵蛋白在制備用于預(yù)防神經(jīng)移行遲緩和/或認(rèn)識發(fā)育遲緩的組合物中的用途。18. 乳鐵蛋白在制備用于預(yù)防學(xué)習(xí)能力受損、精神行為受損、記憶力受損或注意廣度降 低的組合物中的用途。19. 權(quán)利要求16-18任一項的用途，其中組合物被施用于處于妊娠中的母親、處于泌乳 中的母親、早產(chǎn)或如期出生的嬰兒、低出生體重嬰幼兒、IUGR嬰幼兒、嬰幼兒、幼兒、兒童和/ 或青少年。
【專利摘要】概括而言，本發(fā)明涉及腦發(fā)育和腦健康領(lǐng)域。本發(fā)明的一項實施方案涉及可用于治療或預(yù)防腦發(fā)育遲緩和/或神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩的組合物。還可以提高認(rèn)知性能。CNCM I-211619990112
【IPC分類】A23L33/00, A61K38/40, A61P25/28, A23L33/19, A23J1/20, A23C23/00, A23C9/152, A23C19/05
【公開號】CN105435214
【申請?zhí)枴緾N201510968372
【發(fā)明人】B·王, M·福雷, J·施密特
【申請人】雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2010年5月7日
【公告號】CA2761480A1, CN102458450A, CN102458450B, EP2251030A1, EP2429572A1, US8524658, US20120184484, WO2010130643A1