AT
[0180] GACTTCAACTGCTACGATAGGCAGGAGTGTGTGGCCACTGAGGAGAA
[0181] CCCCCAGGTGTACTTCTGCTGCTGTGAAGGCAACTTCTGCAACGAGC
[0182] GCTTCACTCATTTGCCAGAGGCTGGGGGCCCGGAAGTCACGTACGAG
[0183] CCACCCCCGACAGCCCCCACC(SEQ ID NO:19)
[0184] 在具體的實施方式中，本發(fā)明涉及可溶的ActRII多肽。本文所述的術(shù)語"可溶的 ActRII多肽"通常指包含ActRIIa或ActRIIb蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的多肽。本文所用的術(shù)語"可 溶的ActRII多肽"包括任何天然存在的ActRIIa或ActRIIb蛋白及其任何變體(包括突變體、 片段以及擬肽形式）的胞外結(jié)構(gòu)域。活化素-結(jié)合ActRII多肽是一種保留了與活化素(包括 例如，活化素 AA、AB、BB或包含C或E亞基的形式)結(jié)合的能力的多肽?；罨?結(jié)合ActRII多 肽將任選以InM或更小的解離常數(shù)與活化素 AA結(jié)合。ActRII蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域可與活化素 結(jié)合，并通常為可溶的，因此可被稱為可溶的、活化素-結(jié)合ActRII多肽?？扇艿摹⒒罨?結(jié) 合ActRII多肽的實例包括SEQ ID N0: 2、3、7、12和13所示的可溶多肽。SEQ ID N0: 7被稱為 ActRIIa-hFc，并在實施例中得到進一步描述。可溶的、活化素-結(jié)合ActRII多肽的其它實例 包括ActRIIa蛋白胞外結(jié)構(gòu)域以外的信號序列，例如，蜜蜂蜂毒肽前導(dǎo)序列（SEQ ID N0:8)、 組織纖溶酶原激活劑(TPA)前導(dǎo)序列（SEQ ID NO:9)或天然ActRIIa前導(dǎo)序列（SEQ ID NO: 10)。在SEQ ID ^):13中所示的4(^11&-1^多肽采用了?4前導(dǎo)序列。可溶的、活化素-結(jié)合 ActRIIb多肽的實例包括SEQ ID NO: 16、17、20所示的可溶的多肽。活化素-結(jié)合ActRIIb多 肽還可包括ActRIIb蛋白胞外結(jié)構(gòu)域以外的信號序列，例如，蜜蜂蜂毒肽前導(dǎo)序列（SEQ ID NO:8)或組織纖溶酶原激活劑(TPA)前導(dǎo)序列（SEQ ID NO:9)。
[0185] ActRII多肽的功能活性片段可通過篩選從編碼ActRII多肽的核酸的相應(yīng)片段重 組生成的多肽獲得。此外，可采用本領(lǐng)域已知技術(shù)如常規(guī)的Merrifield固相f-Moc或t-Boc 化學(xué)來化學(xué)合成片段。該片段可(通過重組或化學(xué)合成）生成并進行測試，以鑒定能夠作為 ActRII蛋白或活化素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的拮抗劑(抑制劑)的肽基片段。
[0186] ActRII多肽的功能活性變體可通過從編碼ActRII多肽的相應(yīng)突變核酸重組生成 的經(jīng)修飾的多肽的庫篩選獲得。該變體可生成并進行測試，以鑒定能夠作為ActRII蛋白或 活化素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的拮抗劑(抑制劑)的變體。在某些實施方式中，ActRIIa多肽的功能 變體包含與選自SEQ ID N0: 2或3的氨基酸序列具有至少75 %同一性的氨基酸序列。在某些 情況下，該功能變體具有與選自SEQ ID N0:2或3的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、 95%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在某些實施方式中，ActRIIb多肽的功 能變體包含與選自SEQ ID N0:16或17的氨基酸序列具有至少75%同一性的氨基酸序列。在 某些情況下，該功能變體具有與選自SEQ ID N0:17或18的氨基酸序列具有至少80%、85%、 90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。
[0187] 功能變體可通過為增強治療效力或穩(wěn)定性(例如，先體外后體內(nèi)保存期以及對體 內(nèi)蛋白水解降解的耐受性)等目的對ActRII多肽的結(jié)構(gòu)進行修飾后生成。在選擇保留活化 素結(jié)合時，這種修飾的ActRII多肽被認為是天然存在的ActRII多肽的功能等價物。修飾的 ActRII多肽還可通過例如，氨基酸置換、刪除或添加得以生成。例如，可以合理預(yù)期以異亮 氨酸或纈氨酸單獨置換亮氨酸、以谷氨酰胺置換天冬酰胺、以絲氨酸置換蘇氨酸或以結(jié)構(gòu) 相關(guān)氨基酸進行的類似氨基酸置換(例如，保守突變)將不會對所得分子的生物活性產(chǎn)生較 大的影響。保守替換是發(fā)生在側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)的替換。在ActRII多肽的氨基酸序 列中的變化是否得到功能性同系物可通過評估ActRII多肽變體在細胞中以類似于野生型 ActRII多肽的方式生成應(yīng)答的能力容易地測定。
[0188] 在某些實施方式中，本發(fā)明預(yù)期了 ActRII多肽的特定突變以改變該多肽的糖基 化。可通過選擇這種突變來引入或去除一個或多個糖基化位點，例如ο-連接的或N-連接的 糖基化位點。天冬酰胺-連接的糖基化識別位點通常包含三肽序列，天冬酰胺-X-蘇氨酸或 天冬酰胺-X-絲氨酸(其中"X"為任意氨基酸），其被適當(dāng)?shù)募毎腔柑禺愋宰R別。還可 通過對野生型ActRII多肽序列進行一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基的添加或置換(針對0-連接的糖基化位點）以進行該種改變。在糖基化識別位點的第一或第三氨基酸位置之一或 兩者進行的各種氨基酸置換或刪除(和/或在第二位置的氨基酸刪除)可導(dǎo)致在修飾三肽序 列的非糖基化。在ActRII多肽增加糖部分數(shù)量的另一種方式是通過向該ActRII多肽化學(xué)或 酶催化偶聯(lián)糖苷。根據(jù)所用的偶聯(lián)模式，該糖可被連接至(a)精氨酸和組氨酸；（b)游離羧酸 基團；（c)游離巰基基團，例如半胱氨酸的巰基基團；（d)游離羥基基團，例如絲氨酸、蘇氨酸 或羥脯氨酸的羥基基團；（e)芳香殘基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香殘基；或者 (f)谷氨酰胺的酰胺基團。在ActRII多肽上去除一個或多個糖部分可通過化學(xué)和/或酶催化 方法實現(xiàn)。化學(xué)去糖基化可涉及，例如，將該ActRII多肽暴露至化合物三氟甲烷磺酸或同等 的化合物。該處理導(dǎo)致除了連接的糖(N-乙?；咸烟前坊騈-乙?；肴樘前罚┮酝獯蟛糠?或全部糖的裂解，同時保持氨基酸序列完整。在ActRII多肽上糖部分的酶催化裂解可通過 采用Thotakura等人（1987)Meth.Enzymol.l38:350所述的各種內(nèi)切和外切糖苷酶得以實 現(xiàn)。ActRII多肽的序列可根據(jù)所用表達系統(tǒng)的類型進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，因為哺乳動物、酵母、 昆蟲和植物細胞均可導(dǎo)入不同的糖基化類型，其可受到肽的氨基酸序列的影響。一般而言， 用于人類的ActRII蛋白可在提供適當(dāng)糖基化的哺乳動物細胞系中表達，例如HEK293或CH0 細胞系，盡管其它的哺乳動物表達細胞系也預(yù)期有用。
[0189]本公開進一步預(yù)期生成突變體的方法，特別是生成ActRII多肽的組合突變體，以 及截短突變體組;組合突變體集合對于鑒定功能變體序列特別有用。篩選該種組合庫的目 的可以是生成例如結(jié)合活化素或其它配體的ActRII多肽變體。下文提供了多種篩選測定， 該種測定可用于評估變體。例如，可篩選具有結(jié)合ActRII配體的能力的ActRII多肽變體，以 防止ActRII配體與ActRII多肽結(jié)合或者干擾ActRII配體引起的信號傳導(dǎo)。
[0190] ActRII多肽或其變體的活性也可在基于細胞的測定或體內(nèi)測定中進行測試。例 如，可以評估ActRII多肽變體對涉及造血作用的基因表達的影響。根據(jù)需要，這可以在一種 或多種重組ActRII配體蛋白（例如，活化素）的存在下進行，且可轉(zhuǎn)染細胞以生成ActRII多 肽和/或其變體，以及可選的ActRII配體。同樣地，可將ActRII多肽施用至小鼠或其它動物， 并可進行一種或多種血液測量，例如RBC計數(shù)、血紅蛋白或網(wǎng)織紅細胞計數(shù)。
[0191] 可生成相對于天然存在的ActRII多肽具有選擇性或通常更高的效力的組合衍生 變體。同樣地，可突變產(chǎn)生變體，該變體的胞內(nèi)半衰期明顯不同于相應(yīng)的野生型ActRII多 肽。例如，該種改變的蛋白可對于蛋白水解降解或其它導(dǎo)致天然ActRII多肽的破壞或失活 的細胞過程變得更加穩(wěn)定或更加不穩(wěn)定。該種變體以及編碼它們的基因可用于通過調(diào)節(jié)該 ActRII多肽的半衰期來改變ActRII多肽水平。例如，較短的半衰期可以產(chǎn)生更為短暫的生 物效應(yīng)，并對于部分的可誘導(dǎo)表達系統(tǒng)可允許對該細胞中重組ActRII多肽水平的更強控 制。在Fc融合蛋白中，可在接頭(如有)和/或Fc部分進行突變以改變該蛋白的半衰期。
[0192] 組合庫可通過編碼多肽庫的基因的簡并庫得到，其中多肽庫中的每個多肽包含至 少部分的潛在ActRII多肽序列。例如，可將合成的寡核苷酸的混合物酶催化連接至基因序 列，從而使?jié)撛贏ctRII多肽核苷酸序列的簡并組能作為單獨多肽進行表達，或者替代性地， 作為更大的融合蛋白組進行表達(例如，針對噬菌體展示）。
[0193] 可通過多種方式從簡并寡核苷酸序列生成潛在同系物的庫。簡并基因序列的化學(xué) 合成可在自動化DNA合成儀中進行，且該合成的基因可被連接至適當(dāng)?shù)妮d體進行表達。簡并 寡核苷酸的合成已為本領(lǐng)域公知（例如參見Narang，SA(1983)Tetrahedron 39: 3; Itakura 等人，（1981 )Recombinant DNA,Proc . 3rd Cleveland Sympos .Macromolecules ,ed. AG Walton,Amsterdam:Elsevier pp273_289; Itakura等人，（1984)Annu ·Rev ·Biochem. 53: 323;Itakura 等人，（1984)Science 198:1056;Ike 等人，（1983)Nucleic Acid Res.ll: 477)。該種技術(shù)已經(jīng)被用于其它蛋白的直接進化中（例如參見Scott等人，（1990)SCien Ce 249:386-390; Roberts等人，（1992)PNAS USA 89: 2429-2433; Devi in等人，（1990) Science 249:404-406; Cwirla等人，（1990)PNAS USA 87 :6378-6382;以及美國專利5，223，409、5， 198,346和5,096,815)。
[0194] 替代性地，可采用其它的突變形式來生成組合庫。例如，可通過如下方式生成和從 庫中篩選分離ActRII多肽變體，例如，丙氨酸掃描突變等(Ruf等人，（1994)Bi 〇Chemistry 33:1565-1572; Wang 等人，（1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099 ;Balint 等人，（1993)Gene 137:109-118;Grodberg等人，（1993)Eur.J.Biochem.218:597-601;Nagashima等人，（1993) J · Biol · Chem· 268: 2888-2892; Lowman等人，（1991 biochemistry 30 :10832-10838;以及 Cunningham等人，（1989)Science 244:1081-1085)、接頭掃描突變(Gustin等人，（1993) Virology 193:653-660;Brown等人，（1992)Mol · Cell Biol · 12:2644-2652 ;McKnight等人， (1982)Science 232 :316)、飽和突變（Meyers等人，（1986)Science232 :613)、PCR突變 (Leung等人，（1989)Method Cell Mol Biol 1:11-19);或者隨機突變，包括化學(xué)突變等 (Miller等人，（1992)A Short Course in Bacterial Genetics,CSHL Press,Cold Spring Harbor，NY;以及Greener等人，（1994)Strategies in Mol Biol 7:32-34)。接頭掃描突變 (特別是在組合設(shè)置(combinatorial setting)中）是一種具有吸引力的鑒定ActRII多肽的 截短(生物活性)形式的方法。
[0195] 本領(lǐng)域已知從點突變和截短生成的組合庫篩選基因產(chǎn)物的各種技術(shù)，由此已知針 對具有某些屬性的基因產(chǎn)物的cDNA庫篩選技術(shù)。這些技術(shù)將普遍適用于通過ActRII多肽組 合突變生成的基因庫的快速篩選。篩選大型基因庫廣泛應(yīng)用的技術(shù)通常包括將該基因庫克 隆進入可復(fù)制表達載體，以所得的載體庫轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募毎⒃谒杌钚缘臋z測促進編碼 測得產(chǎn)物的基因的載體相對容易分離的條件下表達該組合基因。優(yōu)選的測定包括活化素結(jié) 合測定和活化素-介導(dǎo)的細胞信號傳導(dǎo)測定。
[0196] 在某些實施方式中，本發(fā)明的ActRII多肽可進一步包括在ActRII多肽中天然存在 任意修飾的之外的翻譯后修飾。這些修飾包括，但不限于，乙酰化、羧酸化、糖基化、磷酸化、 脂化和?；Ｆ浣Y(jié)果是，該修飾的ActRII多肽可包含非氨基酸元件，例如聚乙二醇、脂質(zhì)、多 或單糖以及磷酸酯。該種非氨基酸元件對ActRII多肽功能的作用可通過本文所述的針對其 它ActRII多肽變體的方法進行測試。當(dāng)ActRII多肽是通過在細胞中裂解ActRII多肽的新生 形式生成時，翻譯后加工也可能對該蛋白正確的折疊和/或功能非常重要。不同的細胞(例 如，CH0、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)對該種翻譯后活動具有特別的細胞結(jié)構(gòu) 和特征機制，并進行選擇以確保該ActRII多肽的正確修飾和加工。
[0197] 在某些方面，該ActRII多肽的功能變體或修飾形式包括具有該ActRII多肽至少一 部分和一種或多種融合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。公知的該種融合結(jié)構(gòu)域的實例包括，但不限于， 聚組氣fe、Glu-Glu、谷脫甘妝S轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重鏈十旦 定區(qū)(Fc)、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)或人血清白蛋白?？蛇x擇融合結(jié)構(gòu)域來賦予所需的屬性。 例如，部分融合結(jié)構(gòu)域?qū)τ谠撊诤系鞍淄ㄟ^親和層析分離特別有用。針對進行親和純化的 目的，可使用親和層析的相關(guān)基質(zhì)，例如谷胱甘肽_、淀粉酶_、以及鎳-或鈷-結(jié)合的樹脂。該 類基質(zhì)中許多可以"試劑盒"形式提供，例如可用于(HIS6)融合伙伴的Pharmacia GST純化 系統(tǒng)和QIAexpress?系統(tǒng)(Qiagen)。作為另一實例，可選擇融合結(jié)構(gòu)域以促進該ActRII多肽 的檢測。該種檢測結(jié)構(gòu)域的實例包括各種熒光蛋白（例如，GFP)以及"表位標記"，其通常為 短肽序列，由其可獲得特異性抗體。可容易地獲得特異性單克隆抗體的公知表位標記包括 FLAG、流感病毒血細胞凝集素(HA)和c-myc標記。在部分情況下，該融合結(jié)構(gòu)域具有蛋白酶 切割位點，例如Xa因子和凝血酶的切割位點，其允許相關(guān)的蛋白酶部分消化該融合蛋白，從 而由其釋放該重組蛋白。該釋放的蛋白可隨后通過后續(xù)的層析分離從該融合結(jié)構(gòu)域分離出 來。在某些優(yōu)選實施方式中，ActRII多肽與能使該ActRII多肽在體內(nèi)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域（"穩(wěn)定 劑"結(jié)構(gòu)域)相融合。"穩(wěn)定化"表示增加血清半衰期的任意情況，而不論它是由破壞減少、腎 清除率降低或其它藥代動力學(xué)作用所引起。與免疫球蛋白的Fc區(qū)融合已知能對多種蛋白賦 予所需藥代動力學(xué)特性。同樣地，與人血清白蛋白的融合可賦予所需特性。其它可供選擇的 融合結(jié)構(gòu)域類型包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域(其賦予附加的生 物功能，例如對肌肉生長的進一步刺激）。
[0198] 作為特殊的實例，本發(fā)明提供了包含與Fc結(jié)構(gòu)域融合的ActRIIa的可溶胞外結(jié)構(gòu) 域的融合蛋白（例如，SEQ ID N0:6)。
[0199] THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFNWYVDG
[0200] VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCK(A)VSNKALPVPIΕΚΤISKA
[0201] KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
[0202] DGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSLSLSPGK*
[0203] 作為另外的特殊實例，本發(fā)明提供了?含與Fc結(jié)構(gòu)域融合的ActRIIb的可溶胞外 結(jié)構(gòu)域的融合蛋白（例如，SEQ ID N0:21)。
[0204] SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCff
[0205] LDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTH
[0206] TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
[0207] NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPRE
[0208] PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
[0209] YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0210] 可選地，該Fc結(jié)構(gòu)域在例如Asp-265、賴氨酸322和Asn-434等殘基具有一個或多個 突變。在某些情況下，具有一個或多個這些突變(例如，Asp-265突變）的突變體Fc結(jié)構(gòu)域與 FcY受體的結(jié)合能力相對于野生型Fc結(jié)構(gòu)域有所下降。在其它情況下，具有一個或多個這 些突變(例如，Asn-434突變）的該突變體Fc結(jié)構(gòu)域與I類MHC相關(guān)的Fc-受體(FcRN)的結(jié)合能 力相對于野生型Fc結(jié)構(gòu)域有所上升。
[0211] 可以理解該融合蛋白的不同元件可以與所需功能一致的任意方式排列。例如， ActRII多肽可放在異源結(jié)構(gòu)域的C-末端，或者替代性地，異源源結(jié)構(gòu)域可放在ActRII多肽 的c-末端。該ActRII多肽結(jié)構(gòu)域和該異源結(jié)構(gòu)域無需在融合蛋白中彼此接近，在任一結(jié)構(gòu) 域的C-或N-末端或者在結(jié)構(gòu)域之間可包含另外的結(jié)構(gòu)域或氨基酸序列。
[0212] 在某些實施方式中，本發(fā)明的ActRII多肽包含能夠穩(wěn)定該ActRII多肽的一種或多 種修飾。例如，這些修飾提高該ActRII多肽的體外半衰期，提高該ActRII多肽的循環(huán)半衰期 或減少該ActRII多肽的蛋白酶水解降解。這些穩(wěn)定化修飾包括，但不限于，融合蛋白（包括， 例如，包含ActRII多肽和穩(wěn)定劑結(jié)構(gòu)域的融合蛋白），糖基化位點的修飾(包括，例如，向 ActRII多肽添加糖基化位點），以及糖部分的修飾(包括，例如，從ActRII多肽除去糖部分）。 本文所用的術(shù)語"穩(wěn)定劑結(jié)構(gòu)域"不僅指融合蛋白情況下的融合結(jié)構(gòu)域(例如，F(xiàn)c)，還包括 非蛋白質(zhì)性質(zhì)的修飾，例如糖部分，或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的部分，例如聚乙二醇。
[0213] 在某些實施方式中，本發(fā)明提供了 ActRII多肽的分離和/或純化形式，其分離自其 他蛋白，或者基本不含其它蛋白。ActRII多肽通?？赏ㄟ^從重組核酸表達生成。
[0214] 3.編碼ActRII多肽的核酸
[0215]在某些方面，本發(fā)明提供了編碼本文披露的任意ActRII多肽（例如，可溶ActRIIa 多肽和可溶ActRIIb多肽），包括片段、功能變體和融合蛋白的分離和/或重組核酸。例如， SEQ ID N0:4編碼天然存在的人ActRIIa前體多肽，而SEQ ID N0:5編碼加工后的ActRIIa胞 外結(jié)構(gòu)域。例如，SEQ ID N0:18編碼天然存在的人ActRIIb前體多肽，而SEQ ID N0:19編碼 加工后的ActRIIb胞外結(jié)構(gòu)域。所述主題核酸可以是單鏈的或是雙鏈的。這樣的核酸可以是 DNA或RNA分子。這些核酸可以在，例如，制備ActRII多肽的方法中使用，或者直接作為治療 劑(例如，在基因治療方法中）使用。
[0216] 在某些方面，編碼ActRIIa多肽的主題核酸應(yīng)進一步理解為包括為SEQ ID N0:4或 5的變體的核酸。在某些方面，編碼ActRIIb多肽的主題核酸應(yīng)進一步理解為包括為SEQ ID NO: 18或19的變體的核酸。變體核苷酸序列包括區(qū)別為一個或多個核苷酸置換、添加或刪除 的序列，例如等位基因變體。
[0217] 在某些實施方式中，本發(fā)明提供了與SEQ ID N0s:4、5、18或19具有至少80%、 85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的分離或重組核酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員將能理解：與SEQ ID N0s:4、5、18或19互補的核酸序列，以及SEQ ID N0s:4、5、18或19 的變體同樣在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在進一步的實施方式中，本發(fā)明的核酸序列可被分離、重 組和/或與異源核苷酸序列融合，或者在DNA庫中。
[0218]在其它實施方式中，本發(fā)明的核酸還包括在高度嚴格的條件下與SEQ ID N0s:4、 5、18或19中所示的核苷酸序列、SEQ ID N0s:4、5、18或19的互補序列或其片段進行雜交的 核苷酸序列。如上文所討論，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易理解:促進DNA雜交的合適的嚴格 條件是可以變化的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易理解:促進DNA雜交的合適的嚴格條件是可 以變化的。例如，可在6. Ox氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)和約45 °C下雜交，然后在2. OxSSC和50 °C 下洗滌。例如，在該洗滌步驟中的鹽濃度可從低嚴格性的50 °C下約2. OxSSC至高嚴格性的50 °C下約0.2xSSC中選擇。此外，該洗滌步驟中的溫度可從低嚴格性的約22°C的室溫上升至高 嚴格條件下的約65°C。溫度和鹽均可變化，或者可將溫度或鹽濃度保持恒定，而改變其它變 量。在一個實施方式中，本發(fā)明提供在6xSSC和室溫的低嚴格條件下雜交，然后在2xSSC和室 溫下洗滌的核酸。
[0219]由于遺傳密碼的簡并而不同于SEQ ID N0s:4、5、18或19所不核酸的分離核酸同樣 在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，有一個以上的三聯(lián)體(triplet)表示了一系列核酸。表示相同氨 基酸的密碼子，或者同義密碼子(例如，CAU和CAC為組氨酸的同義密碼子)可導(dǎo)致"沉默"突 變，其不影響該蛋白的氨基酸序列。然而，可以預(yù)期在哺乳動物細胞中存在可導(dǎo)致該主題蛋 白（subject protein)的氨基酸序列變化的DNA序列多態(tài)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解:在 編碼特定蛋白的核酸的一個或多個核苷酸(多達約3-5 %的核苷酸）的這些變化可能由于天 然等位基因變化在給定物種的個體中存在。這些核苷酸變化的任意一個或全部以及所得的 氨基酸多態(tài)性均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0220] 在某些實施方式中，本發(fā)明的重組核酸可以在表達構(gòu)建體中可操作地連接至一種 或多種調(diào)節(jié)性核苷酸序列。調(diào)節(jié)性核苷酸序列通常適合用于表達的宿主細胞。本領(lǐng)域已知 針對各種宿主細胞的多種合適的表達載體類型以及合適的調(diào)節(jié)性序列。所述一種或多種調(diào) 節(jié)性核苷酸序列通?？砂ǎ幌抻?，啟動子序列、前導(dǎo)或信號序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn) 錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或活化子序列。本領(lǐng)域已知的組成型 或可誘導(dǎo)啟動子在本發(fā)明的預(yù)期之中。該啟動子可以是天然存在的啟動子，或者是合并了 一個以上啟動子的元件的雜交啟動子。表達構(gòu)建