%的純度。
[0320] ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc顯示了對配體(特別是活化素 A)的高親和性。GDF-11 或活化素 A( "ActA"）通過標準胺偶聯(lián)步驟固定化在Biacore CM5芯片上。將ActRIIa-hFc和 ActRIIa-mFc蛋白加載至該系統(tǒng)，并測量結合。ActRIIa-hFc以5xl012的解離常數(shù)(KD)與活化 素結合，而蛋白以9.96xl0_ 9的KD與⑶F11結合。參見圖2 ActRIIa-mFc的表現(xiàn)與其類似。
[0321 ] ActRIIa-hFc在藥代動力學研究中非常穩(wěn)定。給予大鼠 lmg/kg、3mg/kg或1 Omg/kg 劑量的ActRIIa-hFc蛋白，并在24、48、72、144和168小時測量該蛋白的血漿水平。在另一研 究中，給予大鼠 lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg的劑量。在大鼠體內，ActRIIa-hFc具有11-14天 的血清半衰期，且該藥物的循環(huán)水平在兩周后相當高(初始施用lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg 后分別為111^/1111、11(^/1111或304以〖/1111)。在短尾猴體內，該血衆(zhòng)半衰期遠大于14天，且初 始施用lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg后該藥物的循環(huán)水平分別為25μg/ml、304μg/ml或1440μ g/ml〇
[0322] 實施例2:ActRIIa-hFC在非人靈長動物體內提高紅細胞水平
[0323] 該研究共分四組，每組五只雄性和五只雌性短尾猴，其中計劃在第29天停止每組 每種性別中的三只，并計劃在第57天停止每組每種性別中的兩只。每只動物在第1、8、15和 22天通過靜脈(IV)注射施用載體(組1)或劑量為1、10或30mg/kg的ActRIIa-Fc(組2,3和4)。 劑量體積維持在3mL/kg。在第一次施用前2天和第一次施用后15、29和57天(針對剩余兩只 動物)測量紅細胞水平。
[0324] 在整個研究中的所有劑量水平和時間點下Ac tRIIa-hFc均引起了雄性和雌性體內 平均紅細胞參數(shù)(紅細胞數(shù)[RBC]，血紅蛋白[HGB]，血細胞比容[HCT])的統(tǒng)計學上顯著升 高，并伴有絕對和相對網織紅細胞數(shù)(ARTC; RTC)的增加。參見圖3-6。
[0325] 計算每個治療組相對于該治療組基線均值的統(tǒng)計顯著性。
[0326]明顯的，紅細胞數(shù)和血紅蛋白水平的上升的幅度約等于對促紅細胞生成素所報導 的作用。ActRIIa-Fc的這些作用的開始比促紅細胞生成素更為快速。
[0327]在大鼠和小鼠中觀察到了類似的結果。
[0328] 實施例3:ActRIIa-hFc在人類患者體內提高紅細胞水平
[0329] 將實施例1中描述的融合蛋白在隨機、雙盲、安慰劑對照的研究中施用至人類患 者，該研究主要用于評估該蛋白對健康、絕經后女性的安全性。48位對象被隨機分為6組，以 接受單劑量的ActRIIa-hFc或安慰劑（5活性：1安慰劑）。劑量水平范圍為靜脈（IV)0.01-3.〇11^/1^，皮下（5〇0.03-〇.11^/1^。所有的對象均隨訪120天。除了藥代動力學(？1〇分析， 還通過測量骨形成和再吸收的生物標記以及FSH水平來評估ActRIIa-hFc的生物活性。 [0330]為了尋找潛在的變化，在研究過程中詳細檢查每個對象的血紅蛋白和RBC數(shù)，并與 基線水平進行比較。在相同的時間將血小板數(shù)與對照進行比較。血小板數(shù)隨時間并未對基 線值產生具有臨床意義的變化。
[0331] 對ActRIIa-hFc的PK分析顯示了與劑量呈線性的曲線，平均半衰期約為25-32天。 ActRIIa-hFc的曲線下面積(AUC)與劑量線性相關，且在SC給藥后的吸收基本完全(參見圖7 和8)。這些數(shù)據顯示SC是理想的給藥途徑，因為它為該藥物提供了等同的生物利用度和血 清半衰期，同時避免了 IV給藥首幾天內出現(xiàn)的藥物血清濃度的峰值(見圖8) ictRIIa-hFc 引起了骨特異性的堿性磷酸酶(BAP)(合成骨生長的標記）的血清水平的快速、持續(xù)的劑量 依賴型上升，以及C末端1型膠原端肽和抗酒石酸酸性磷酸酶5b水平(骨再吸收的標記)的劑 量依賴型下降。其它的標記(如P1NP)顯示了不確定的結果。BAP水平在最高藥物劑量下顯示 接近飽和效應，表示在0.3mg/kg的劑量下可實現(xiàn)對該合成骨標記半最大效應，其可上升達 3mg/kg。由藥物的藥效作用相對AUC的關系計算得到EC50為51，465(天*ng/ml)。參見圖9。在 所測試的最高劑量水平下，這些骨標記的變化持續(xù)約120天。與活化素的抑制相一致，血清 FSH水平也存在劑量依賴型下降。
[0332] 整體而言，在研究的第一周僅有極少的非藥物相關性血紅蛋白減少，這可能與不 管是IV還是SC給予的0.01和0.03mg/kg組的靜脈切開放血研究相關。0. lmg/kg SC和IV血紅 蛋白結果在第8-15天保持穩(wěn)定或者顯示了略微的上升。在0.3mg/kg IV劑量水平，早達第2 天便可看到HGB水平的明顯上升，并通常在第15-29天出現(xiàn)峰值，這在安慰劑對象中并未出 現(xiàn)。在該研究點上，該變化未達到統(tǒng)計顯著性。
[0333] 總體而言，ActRIIa-hFc顯示了對紅細胞數(shù)和網織紅細胞數(shù)的劑量依賴型作用。對 血液學變化的總結參見圖10-13。
[0334] 實施例4:替代性ActRIIa-Fc蛋白
[0335] 公布為W02006/012627(例如，參見第55-58頁）的國際專利申請中描述了多種可參 照本文所述的方法使用的ActRIIa變體，其全文在此引入作為參考。替代性的構建體可刪除 C末端尾部(ActRIIa胞外結構域的最后15個氨基酸）。該種構建體的序列顯示如下(Fc部分 下劃線顯示）（SEQ ID N0:12):
[0336] ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWL
[0337] DDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMTGGGTHTCPPCPAPELLGGPS
[0338] VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNVYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
[0339] YRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT
[0340] KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQG [0341 ] NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0342] 實施例5:ActRIIb_Fc融合多肽
[0343] 申請人構建了可溶ActRIIb融合蛋白，其具有連接至人Fc結構域的人ActRIIb胞外 結構域?；罨睾桶釧ctRIIb的共結晶結構未顯示配體結合中的胞外結構域最后(C末端） 15個氨基酸(此處稱為"尾部"）的任何作用。該序列未能從晶體結構上分辨(resolve)，提示 這些殘基存在于未均一填充在該晶體中的柔性環(huán)(flexible loop)中。Thompson等人ΕΜΒ0 J.2003Apr 1;22(7): 1555-66。該序列在ActRIIb和ActRIIa之間保守性較差。因此，這些殘 基在基本的，或背景，ActRIIb-Fc融合構建體中缺失。此外，在背景形式的64號位置由丙氨 酸占據，這通常被認為是"野生型"形式，盡管天然存在A64R等位基因。因此，背景ActRIIb-Fc融合體具有如下序列(Fc部分下劃線顯示）（SEQ ID N0:20):
[0344] SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCff
[0345] LDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGGTHTCPPCPAPELLGGPS
[0346] VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNVYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
[0347] YRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT
[0348] KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRffQQG
[0349] NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0350] 令人驚奇的是，業(yè)已發(fā)現(xiàn)該C末端尾部增強了活化素和GDF-11結合，因此優(yōu)選的 ActRIIb-Fc形式具有如下序列(Fc部分下劃線顯示）（SEQ ID N0:21):
[0351] SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWANSSGTIELVKKGCff
[0352] LDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTH
[0353] TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNVYVDGVEVH
[0354] NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPRE
[0355] PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
[0356] YSKLTVDKSRffQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0357] 公布為W02006/012627(例如，參見第59-60頁）的國際專利申請中描述了多種可參 照本文所述的方法使用的ActRIIb變體，其全文在此引入作為參考。
[0358] 實施例6:ActRIIb-hFc在非人類靈長動物體內刺激紅細胞生成
[0359] 在1個月中每周一次通過皮下注射向雄性和雌性短尾猴施用ActRIIb-hFc(IgGl)。 將48只短尾猴(24/性別)分配至四個治療組(6動物/性別/組）中的一個，并在4周中每周一 次皮下注射載體或者3、10或30mg/kg的ActRIIb-hFc(總共5個劑量）。評估參數(shù)包括一般臨 床病理學(血液學、臨床化學、凝固和尿檢）。ActRIIb-hFc在治療動物中于第15天前引起了 平均絕對網織紅細胞值的統(tǒng)計顯著性上升。至第36天，ActRIIb-hFc引起了多種血液學變 化，包括上升的平均絕對網織紅細胞和紅細胞分布寬度值和下降的平均細胞血紅蛋白濃 度。所有治療組別和兩種性別均受到影響。這些作用與ActRIIb-hFc對來自骨髓的不成熟網 織紅細胞釋放的陽性作用一致。當藥物從被治療動物體內清除后（至研究的第56天），這種 作用被逆轉。因此，我們總結認為ActRIIb-hFc刺激紅細胞生成。
[0360] 引用參考
[0361] 本文所提及的所有公布和專利均全文引入作為參考，其引用程度如同每一個單獨 的公布和專利均被特別地和單獨地引入作為參考。
[0362]盡管已經討論了該主題特殊的實施方式，以上的說明書僅作闡述之用，而不具有 限制性。在閱讀本說明書和以下權利要求書后，本發(fā)明的許多變型對于本領域技術人員而 言將是顯而易見的。本發(fā)明的完整范圍應當參照權利要求書及其所有的等同范圍以及說明 書及各種變型得以確定。
【主權項】
1. 多肽在制備用于在有此需要的患者中治療骨髓增生異常綜合征、治療血紅蛋白病、 治療地中海貧血、治療鐮形細胞疾病、提高紅細胞水平或提高血紅蛋白水平的藥物中的用 途，其中所述多肽選自： a) 包含與SEQ ID N0:2具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽； b) 包含與SEQ ID NO:3具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽； c) 包含與SEQ ID NO:7具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽； d) 包含與SEQ ID NO: 12具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽 e) 包含與SEQ ID NO: 16具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽； f) 包含與SEQ ID NO: 17具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽； g) 包含與SEQ ID N0:20具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽;和 h) 包含與SEQ ID N0:21具有至少90%同一性的氨基酸序列的的多肽。2. 用于在有此需要的患者中治療骨髓增生異常綜合征、治療血紅蛋白病、治療地中海 貧血、治療鐮形細胞疾病、提高紅細胞水平或提高血紅蛋白水平的多肽，其中所述多肽選 白：： a) 包含與SEQ ID N0:2具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽； b) 包含與SEQ ID N0:3具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽； c) 包含與SEQ ID N0:7具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽； d) 包含與SEQ ID NO: 12具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽 e) 包含與SEQ ID NO: 16具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽； f) 包含與SEQ ID NO: 17具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽； g) 包含與SEQ ID N0:20具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽;和 h) 包含與SEQ ID N0:21具有至少90%同一性的氨基酸序列的的多肽。3. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽結合活化素和/或GDF11。4. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID NO:3具有至少90% 同一性的氨基酸序列。5. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID NO:3具有至少95% 同一性的氨基酸序列。6. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。7. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID NO:2具有至少90% 同一性的氨基酸序列。8. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID NO:2具有至少95% 同一性的氨基酸序列。9. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。10. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID NO: 17具有至少 90%同一性的氨基酸序列。11. 如權利要求1所述的用途，其中所述多肽包含與SEQ ID NO: 17具有至少95%同一性 的氨基酸序列。12. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序 列。13. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID NO: 16具有至少 90%同一性的氨基酸序列。14. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID NO: 16具有至少 95%同一性的氨基酸序列。15. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序 列。16. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID N0:7具有至少 90%同一性的氨基酸序列。17. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID N0:7具有至少 95%同一性的氨基酸序列。18. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含SEQ ID N0:7的氨基酸序 列。19. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID NO: 12具有至少 90%同一性的氨基酸序列。20. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID NO: 12具有至少 95%同一性的氨基酸序列。21. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序 列。22. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID N0:20具有至少 90%同一性的氨基酸序列。23. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID N0:20具有至少 95%同一性的氨基酸序列。24. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含SEQ ID N0:20的氨基酸序 列。25. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID N0:21具有至少 90%同一性的氨基酸序列。26. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含與SEQ ID N0:21具有至少 95%同一性的氨基酸序列。27. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含SEQ ID N0:21的氨基酸序 列。28. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽結合活化素。29. 如權利要求28所述的用途，其中所述多肽結合活化素 A。30. 如權利要求28所述的用途，其中所述多肽結合活化素 B。31. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽結合GDF11。32. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽結合活化素和GDF11。33. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽具有一種或多種如下特征： i) 以至少10-7 Μ的KD結合ActRII配體;和 ii) 在細胞中抑制ActRII信號傳導。34. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽是包含免疫球蛋白Fc結構域的 融合蛋白。35. 如權利要求34所述的用途，其中所述免疫球蛋白Fc結構域是IgGl Fc結構域。36. 如權利要求1或2所述的用途或多肽，其中所述多肽包含選自如下的一種或多種修 飾的氨基酸殘基:糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物 素化氨基酸以及與脂質部分綴合的氨基酸。37. 如權利要求34所述的用途，其中所述藥物用于施用，從而在患者體內達到融合蛋白 的至少100 ng/ml的血清濃度持續(xù)約20至30天的時間。38. 如權利要求34所述的用途，其中所述藥物用于施用，從而在患者體內達到融合蛋白 的100 ng/ml至1000 ng/ml范圍內的血清濃度。39. 如權利要求34所述的用途，其中所述融合蛋白具有介于15和30天之間的血清半衰 期。40. 如權利要求34所述的用途，其中所述藥物用于以不超過每周一次的頻率施用至所 述患者。41. 如權利要求34所述的用途，其中所述藥物用于以不超過每月一次的頻率施用至所 述患者。42. 用于制備用于治療骨髓增生異常綜合征的藥物的如權利要求1-41中任一項所述的 用途或多肽。43. 用于制備用于治療血紅蛋白病的藥物的如權利要求1-41中任一項所述的用途或多 肽。44. 權利要求43的用途或多肽，其中所述血紅蛋白病是鐮形細胞疾病。45. 權利要求43的用途或多肽，其中所述血紅蛋白病是地中海貧血。46. 用于制備提高紅細胞水平的藥物的權利要求1-42中任一項的用途或多肽。47. 用于制備提高血紅蛋白水平的藥物的權利要求1-42中任一項的用途或多肽。48. 活化素-ActRII拮抗劑在制備用于在有此需要的患者中治療骨髓增生異常綜合征、 治療血紅蛋白病、治療地中海貧血、治療鐮形細胞疾病、提高紅細胞水平或提高血紅蛋白水 平的藥物中的用途，其中所述活化素-ActRII拮抗劑選自： a) 結合活化素的抗體； b) 結合ActRII的抗體;和 c) 卵泡抑素;和 d) 抑制素。49. 用于在有此需要的患者中治療骨髓增生異常綜合征、治療血紅蛋白病、治療地中海 貧血、治療鐮形細胞疾病、提高紅細胞水平或提高血紅蛋白水平的拮抗劑，其中所述拮抗劑 選自： a) 結合活化素的抗體； b) 結合ActRII的抗體;和 c) 卵泡抑素;和 d) 抑制素。50. 權利要求49的用途或拮抗劑，其中所述活化素-ActRII拮抗劑是破壞活化素-Ac tR II a結合的抗體。51. 權利要求49的用途或拮抗劑，其中所述活化素-ActRII拮抗劑是結合活化素 A的抗 體。52. 權利要求49的用途或拮抗劑，其中所述活化素-ActRII拮抗劑是結合活化素 B的抗 體。53. 權利要求49的用途或拮抗劑，其中所述活化素-ActRII拮抗劑是卵泡抑素。54. 權利要求53的用途或拮抗劑，其中所述活化素-ActRII拮抗劑是卵泡抑素-288。55. 權利要求53的用途或拮抗劑，其中所述活化素-ActRII拮抗劑是卵泡抑素-315。56. 權利要求49的用途或拮抗劑，其中所述活化素-ActRII拮抗劑是抑制素。57. 權利要求49的用途或拮抗劑，其中所述多肽具有一種或多種如下特征： i) 以至少10-7 Μ的KD結合ActRII配體;和 ii) 在細胞中抑制ActRII信號傳導。58. 如權利要求49的用途或拮抗劑，其中所述藥物用于施用，從而在患者體內達到活化 素-ActRII詰抗劑的至少100 ng/ml的血清濃度持續(xù)約20至30天的時間。59. 如權利要求49的用途或拮抗劑，其中所述藥物用于施用，從而在患者體內達到活化 素-ActRII詰抗劑的100 ng/ml至1000 ng/ml范圍內的血清濃度。60. 如權利要求49的用途或拮抗劑，其中所述融合蛋白具有介于15和30天之間的血清 半衰期。61. 如權利要求49的用途或拮抗劑，其中所述藥物用于以不超過每周一次的頻率施用 至所述患者。62. 如權利要求49的用途或拮抗劑，其中所述藥物用于以不超過每月一次的頻率施用 至所述患者。63. 用于制備用于治療骨髓增生異常綜合征的藥物的如權利要求49-61中任一項所述 的用途或拮抗劑。64. 用于制備用于治療血紅蛋白病的藥物的如權利要求49-61中任一項所述的用途或 拮抗劑。65. 權利要求64的用途或拮抗劑，其中所述血紅蛋白病是鐮形細胞疾病。66. 權利要求64的用途或拮抗劑，其中所述血紅蛋白病是地中海貧血。67. 用于制備提高紅細胞水平的藥物的權利要求49-61中任一項的用途或拮抗劑。68. 用于制備提高血紅蛋白水平的藥物的權利要求49-61中任一項的用途或拮抗劑。
【專利摘要】在某些方面，本發(fā)明提供了用于提高脊椎動物中紅細胞和/或血紅蛋白水平的組合物和方法，所述脊椎動物包括嚙齒動物和靈長動物，特別是人。
【IPC分類】A61K38/00, A61P7/00, A61P7/06, A61K39/395, C07K19/00, A61K38/17, C07K14/71
【公開號】CN105582521
【申請?zhí)枴緾N201610145040
【發(fā)明人】M.L.謝爾曼
【申請人】阿塞勒隆制藥公司
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2007年12月18日
【公告號】CA2672758A1, CN101687015A, CN104524548A, EP2124999A2, EP2124999B1, EP2446896A1, EP2468290A1, EP2468290B1, EP2468291A1, US7988973, US8007809, US20090047281, US20090163417, US20100204092, US20120052067, WO2008076437A2, WO2008076437A3, WO2008076437A9