用于治療成膠質細胞瘤的組合療法
【專利說明】用于治療成膠質細胞瘤的組合療法 發(fā)明領域
[0001] -般地，本發(fā)明關注用抗VEGF抗體治療疾病和病理疾患。更具體地，本發(fā)明關注與 一種或多種別的抗腫瘤治療劑組合，使用抗VEGF抗體治療易患上或診斷有成膠質細胞瘤的 人患者。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 膠質瘤占所有惡性腦和CNS腫瘤的81%。特別地，成膠質細胞瘤（多形性成膠質細 胞瘤(GBM);世界衛(wèi)生組織(WHO) IV級星形細胞瘤）占惡性膠質瘤的60 %至70 %，而且仍然是 膠質瘤中最具攻擊性的亞型。它大多在成人中發(fā)生(診斷時的中值年齡:64歲），而且它在美 國的發(fā)病率估算是3.05/100,000。鑒于1年和5年總體存活分別為29%和3%，成膠質細胞瘤 的預后仍然是特別差的（美國中樞腦腫瘤登記(2005)(CBTRUS; http: //Vww. cbtrus. org))。
[0004] 雖然成膠質細胞瘤的治療取得了一些進展，但是運種疾病呈現高度未滿足的醫(yī)療 需求，只有有限的治療選項。特別地，貝伐珠單抗（Avastin坂）（一種祀向促血管發(fā)生性血 管內皮生長因子(VEG巧的單克隆抗體)具有顯著的治療潛力。
[000引發(fā)明概述
[0006] 本發(fā)明提供用于治療診斷有成膠質細胞瘤的患者(包括新診斷有成膠質細胞瘤的 患者）的方法和試劑盒。
[0007] 在一個方面，本發(fā)明提供治療診斷有成膠質細胞瘤的患者的方法，其包括對該患 者施用包括有效量的抗VEGF抗體，有效量的化療劑，和有效量的放療的療法，其中與在沒有 抗VEG巧亢體的情況下接受化療劑的成膠質細胞瘤患者相比，該治療延長患者的中值總體存 活(OS)時間。
[0008] 在另一個方面，本發(fā)明特征在于有效量的抗VEGF抗體，化療劑，和放療在制備藥物 中的用途，該藥物用于與在沒有抗VEG巧亢體的情況下接受所述化療劑的成膠質細胞瘤患者 相比延長診斷有成膠質細胞瘤的患者的中值總體存活時間。
[0009] 在另一個方面，本發(fā)明特征在于一種組合物，其包含有效量的抗VEGF抗體，化療 劑，和放療，供與在沒有抗VEGF抗體的情況下接受所述化療劑的成膠質細胞瘤患者相比延 長診斷有成膠質細胞瘤的患者的中值總體存活時間的方法中使用。
[0010] 在任一上述方面的一些實施方案中，患者可W具有含2的W冊性能狀態(tài)。在一些實 施方案中，化療劑可W是替莫挫胺(temozolomideKTMZ)。在一些實施方案中，TMZ的有效量 可W是150mg/m 2，任選口服施用。在一些實施方案中，TMZ的有效量可W是200mg/m2，任選口 服施用。在一些實施方案中，放療可W W2Gy施用。在一些實施方案中，抗VEG巧亢體可W結合 A4.6.1表位。在一些實施方案中，抗VEGF抗體可W是貝伐珠單抗(be vac izumab)。在一些實 施方案中，抗VEGF抗體可W包含可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)，其中VH可W具有氨基酸序 列
[001引（SEQ ID N0:2)且化可W具有氨基酸序列
[0016] (SEQ ID N0:1)。在一些實施方案中，抗VEGF抗體的有效量可W是約lOmg/kg(例如 lOmg/kg)，任選每兩周靜脈內施用，而且可W是例如最初在90分鐘里靜脈內施用，后續(xù)輸注 在60分鐘里，然后在30分鐘里。在一些實施方案中，抗VEGF抗體的有效量可W是約15mg/kg (例如15mg/kg)，任選每兩周靜脈內施用，而且可W是例如最初在90分鐘里靜脈內施用，后 續(xù)輸注在60分鐘里，然后在30分鐘里。在一些實施方案中，可W在第一個周期第一個對患者 施用抗VEGF抗體，而且任選地，抗VEGF抗體的任何后續(xù)施用可W在化療劑之前或之后。在另 一個實施方案中，可W與化療劑和任選的放療并行施用抗VEG巧亢體。在一些實施方案中，可 W中止對患者施用類固醇。在一些實施方案中，成膠質細胞瘤是前神經(proneural)亞型 的。在一些實施方案中，成膠質細胞瘤是新診斷的成膠質細胞瘤。
[0017] 在上文所述方法，用途，和組合物中，與在沒有抗VEG巧亢體的情況下接受化療劑的 成膠質細胞瘤患者相比，中值OS時間可W延長約4.9個月，危害比化R)等于約0.42。在另一 個實施方案中，與在沒有抗VEGF抗體的情況下接受化療劑的成膠質細胞瘤患者相比，中值 OS時間可W延長約4.9個月，HR為約0.24至約0.72。在另一個實施方案中，與在沒有抗VEGF 抗體的情況下接受化療劑的成膠質細胞瘤患者相比，中值OS時間可W延長至少5個月或更 多，HR為約0.24至約0.72。在上文所述方法的一些實施方案中，患者可W小于65歲。在上文 所述方法的其它實施方案中，患者可W等于或大于65歲。
[0018] 在另一個方面，本發(fā)明提供試劑盒，其包括本質上結合表位A4.6.1的抗VEGF抗體， 化療劑，和印有治療診斷有成膠質細胞瘤的患者的說明書的包裝插頁或標簽，包括對患者 施用有效量的抗VEGF抗體和化療劑，其中與在沒有抗VEG巧亢體的情況下接受化療劑的成膠 質細胞瘤患者相比，治療延長患者的中值OS時間。在運個方面的一些實施方案中，患者可W 已經接受過兩種或少數在先抗癌方案。在運個方面的一些實施方案中，抗VEGF抗體可W是 貝伐珠單抗。在運個方面的一些實施方案中，成膠質細胞瘤是前神經亞型的。在運個方面的 一些實施方案中，成膠質細胞瘤是新診斷的成膠質細胞瘤。
[0019] 附圖簡述
[0020] 圖1是一幅圖，顯示實施例1中更為詳細公開的兩分支HI期研究設計治療順序。研 究治療始于成膠質細胞瘤削體手術或活檢之后4至7周且包括3個不同階段:并行階段，期間 與替莫挫胺(TMZ)和放療組合每兩周施用lOmg/kg貝伐珠單抗或安慰劑，繼W28天治療休 息；維持階段，期間與TMZ組合每兩周施用lOmg/kg貝伐珠單抗或安慰劑；和單一療法階段， 期間每=周施用15mg/kg貝伐珠單抗或安慰劑直至疾病進展。
[0021] 圖2A是一幅圖，顯示具有前神經(PN)型成膠質細胞瘤的評估患者的無進展存活 (PFS)的KapIan Meier曲線，所述患者來自圖1中概述的III期AvaGliO試驗中的安慰劑和貝 伐珠單抗治療分支。n = 99。
[0022] 圖2B是一幅圖，顯示具有前神經(PN)型成膠質細胞瘤的評估患者的總體存活(OS) 的Kap 1 an Meier曲線，所述患者來自圖1中概述的III期AVaG 1 iO試驗中的安慰劑和貝伐珠 單抗治療分支。n = 99。
[0023] 圖3是一幅圖，顯示來自HI期AvaGlio試驗的治療分支的具有PN(n = 95)和非PN(n = 235)型成膠質細胞瘤的患者的OS,通過多變量分析為已知的臨床預后因子進行了調整。 對于具有IDHl野生型PN成膠質細胞瘤的患者，將貝伐珠單抗添加至RT和化療治療在延長OS 方面賦予統(tǒng)計學顯著的受益化R:0.42,95%CI:0.24-0.72，p = 0.002;PN亞型和貝伐珠單抗 治療之間的相互作用:P = 0.012) Dn = 10位IDHl突變陽性患者和n = 9位協(xié)變量信息缺失患 者排除在多變量Cox比例風險分析之外。圖3是基于圖4A和4B中所示相同多變量分析的匯 總。
[0024]圖4A是一幅圖，顯示在考慮已知的預后協(xié)變量時，貝伐珠單抗治療的具有 化mips分類的PN亞型成膠質細胞瘤的患者的顯著OS受益。卸<0.5，*卸<0.05。
[002引圖4B是一幅圖，顯示在考慮已知的預后協(xié)變量時，貝伐珠單抗治療的具有 化i Ilips分類的非PN亞型成膠質細胞瘤的患者沒有顯示顯著OS受益。卸<0.5，*卸<0.05。
[0026] 圖5A是一幅圖，顯示在考慮已知的預后協(xié)變量時，貝伐珠單抗治療的具有TCGA分 類的PN亞型成膠質細胞瘤的患者的顯著OS受益。卸<0.5，*卸<0.05。
[0027] 圖5B是一幅圖，顯示在考慮已知的預后協(xié)變量時，貝伐珠單抗治療的具有TCGA分 類的非PN亞型成膠質細胞瘤的患者沒有顯示顯著OS受益。卸<0.5，*卸<0.05。
[002引發(fā)明詳述
[0029] I.定義
[0030] 術語"抗血管發(fā)生劑"或"血管發(fā)生抑制劑"指或是直接或是間接抑制血管發(fā)生 (angiogenesis)，血管生成（vasculogenesis)或不想要的血管通透性的小分子量物質，多 核巧酸，多膚，分離的蛋白質，重組蛋白，抗體，或其綴合物或融合蛋白。應當理解，抗血管發(fā) 生劑包括那些結合并阻斷血管發(fā)生性因子或其受體的血管發(fā)生活性的藥劑。例如，抗血管 發(fā)生劑是說明書全文定義的或本領域已知的血管發(fā)生劑的抗體或其它括抗劑，例如但不限 于VEGF-A的抗體，VEGF-A受體(例如KDR受體或Fl t-1受體）的抗體，VEGF陷阱，抗PDGFR抑制 劑諸如Gleevec?(Imatinib Mesylate)?？寡馨l(fā)生劑還包括天然血管發(fā)生抑制劑，例如血 管他下（angi OStat in)，內皮他下（endo S tat in)等。參見例如Klagsbrun and D ' Amore , Annu.Rev.曲ysiol53:217-39(1991);Streit and Detmar,Oncogene,22:3172-3179 (2003)(例如列舉惡性黑素瘤中的抗血管發(fā)生療法的表3) ;Ferrara&Alitalo ,Nature Medicine 5:1359-1364(1999);Tonini et al. ,Oncogene,22:6549-6556(2003)(例如列舉 已知的抗血管發(fā)生性因子的表2);及Sato. Int. J. Cl in. Oncol.，8: 200-206 (2003)(例如列 舉臨床試驗中所使用的抗血管發(fā)生劑的表1)。
[0031] 本文中的術語"抗體"W最廣義使用，并且涵蓋各種抗體結構，包括但不限于單克 隆抗體，多克隆抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體），和抗體片段，只要它們展現出期 望的抗原結合活性。
[0032] 術語"VEGf或"VEGF-A"用于指165個氨基酸的人血管內皮細胞生長因子及相關的 121個，145個，189個和206個氨基酸的人血管內皮細胞生長因子，如例如Leung et al.， Science,246:1306(1989);及Houck et al.，Mol.化docrin. ,5:1806(1991)所述，及其天然 存在的等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F和 PlGF在內的基因家族的一部分。VEGF-A主要結合兩種高親和力受體酪氨酸激酶，即VEGFR-I (Flt-I)和VEGFR-2(Flk-l/KDR)，后者是VEGF-A血管內皮細胞有絲分裂信號的主要遞質。另 夕h神經拉蛋白-1已經被鑒定為肝素結合VEGF-A同種型（i SOf orm)的受體，而且可在血管發(fā) 育中發(fā)揮作用。術語"VEGF"或"VEGF-A"還指來自非人物種諸如小鼠，大鼠或靈長類動物的 VEGF。有時，來自特定物種的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠 VEGF。通常， VEGF指人VEGF。術語"VEGF"還用于指包含165個氨基酸的人血管內皮細胞生長因子的氨基 酸8-109或1-109的多膚的截短形式或片段。本申請中可能通過例如"VEGF(8-109r ,"VEGF (1-109)"或"VEGF165"來鑒別任何此類形式VEGF的提述。"截短的"天然VEGF的氨基酸位置 如天然VEGF序列中所示編號。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸（甲硫氨酸)也是天 然VEGF中的第17位（甲硫氨酸）。截短的天然VEGF具有與天然VEGF相當的對KDR和Fl t-1受體 的結合親和力。
[003引"抗VEGF抗體"指W足夠親和力和特異性結合VEGF的抗體。所選擇的抗體通常會具 有對VEGF的結合親和力，例如，該抗體可W W介于IOOnM-IpM之間的Kd值結合hVEGF?？贵w親 和力可通過例如基于表面等離振子共振的測定法（諸如PCT申請公開文本No. W02005/ 012359中所記載的BIAcore測定法）；酶聯(lián)免疫吸附測定法化LISA);和競爭測定法（例如 RIA)來測定。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗VEG巧亢體可用作治療劑，用于祀向和干擾其中 設及VEGF活性的疾病或疾患。還有，可對該抗體進行其它生物學活性測定法，例如為了評估 其作為治療劑的效力所進行的生物學活性測定法。此類測定法是本領域已知的，而且取決 于抗體的祀抗原和預定用途。例子包括冊制測定法;腫瘤細胞生長抑制測定法(如例 如WO 89/06692中所記載的）；抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)和補體介導的細胞毒性 (CDC)測定法(美國專利No. 5,500,362);及激動活性或造血測定法(參見WO 95/27062)?？?VEGF抗體通常不會結合其它VEGF同系物，諸如VEGF-B或VEGF-C，也不會結合其它生長因子， 諸如 P1GF，PDGF 或 bFGF。
[0034]抗VEGF抗體。貝伐珠單抗"（Bevacizumab;BV或Bev)是依照Pres1:a et al. ,Cancer Res. 57:4593-4599(1997)生成的重組人源化抗VEGF單克隆抗體，也稱作"rhuMAb VEGF"或 "AVAST的⑧''。它包含突變的人IgGl框架區(qū)和來自鼠抗hVEGF單克隆抗體A. 4.6.1 (其阻 斷人VEGF對其受體的結合)的抗原結合互補決定區(qū)。貝伐珠單抗大約93%的氨基酸序列(包 括大部分框架區(qū)）衍生自人IgGl，而約7%的序列衍生自鼠抗體A4.6.1。貝伐珠單抗具有約 149，000道爾頓的分子量且是糖基化的。其它抗VEGF抗體包括美國專利No. 6，884，879和WO 2005/044853中記載的抗體。
[003引"表位A4.6. r指受抗VEGF抗體貝伐珠單抗（AVASTIN? )(參見Muller et曰1.， Struc化re 6:1153-1167，1998)識別的表位。在本發(fā)明的某些實施方案中，抗VEGF抗體包括 但不限于與由雜交瘤ATCC皿10709生成的單克隆抗VEGF抗體A4.6.1結合相同表位的單克 隆抗體；依照Pres1:a et al.,(Mincer Res.57:4593-4599,1997生成的重組人源化抗VEGF單 克隆抗體。
[0036]依照本發(fā)明的"功能性表位"指抗原中有力地促進抗體結合的氨基酸殘基。抗原中 貢獻巨大的殘基中任一個的突變(例如，丙氨酸對野生型VEGF的突變或同系物突變)會破壞 抗體的結合，使得抗體的相對親和力比（I巧0突變型VEGF/I巧0野生型VEGF)會大于5(參見 W02005/012359的實施例2)。在一個實施方案中，相對親和力比是通過溶液結合隧菌體展示 ELISA測定的。簡言之，將96孔Maxiso巧免疫板(NUNC)用Fab形式的待測試抗體WPBS中化g/ ml的濃度于4°C包被過夜，并用PBS，0.5%BSA，和0.05%Tween20(PBT)于室溫封閉2小時。首 先將展示hVEGF丙氨酸點突變體(殘基8-109形式)或野生型hVEGF(8-109)的隧菌體在PBT中 的連續(xù)稀釋液在化b包被的板上于室溫溫育15分鐘，并用PBS，0.05%Tween20(PBST)清洗 板。用在PBT中1:5000稀釋的抗M13單克隆抗體辣根過氧化物酶(Amersham陸armacia)綴合 物檢測所結合的隧菌體，用3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB，Kirkegaard&Perry Labs， Gaithersburg, MD)底物顯色大約5分鐘，用1.0 M曲P〇4澤滅，并W分光光度法于450皿讀數。 IC50值的比（I巧0，ala/IC50，wt)代表了結合親和力的降低倍數(相對結合親和力）。
[0037] 抗VEGF抗體雷尼珠單抗(Ranibizumab)或LUCENT1S坂抗體或rhuFab V2是一種 人源化的親和力成熟的抗人VEGF Fab片段。雷尼珠單抗是通過大腸桿菌表達載體中的標準 重組技術方法和細菌發(fā)酵生成的。雷尼珠單抗不是糖基化的且具有約48,000道爾頓的分子 量。參見WO 98/45331 及US 2003/0190317。
[0038] "分離的"抗體指已經鑒定且自其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的抗體。其天然 環(huán)境的污染性成分指會干擾該抗體的研究，診斷或治療用途的物質，可包括酶，激素，和其 它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在有些實施方案中，將抗體純化至（1)根據例如 Lowry法的測定，抗體重量超過95%，而在有些實施方案中，重量超過99%，（2)足W通過使 用例如轉杯式測序儀獲得至少15個殘基的N端或內部氨基酸序列的程度，或(3)根據還原性 或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用例如考馬斯藍或銀染劑，達到同質。既然抗體天然環(huán) 境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，分離的抗 體通常會通過至少一個純化步驟來制備。
[0039] "天然抗體"指通常由兩條相同的輕化)鏈和兩條相同的重化)鏈構成的約150,000 道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫化物連接的 數目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內二 硫橋。每條重鏈在一端具有一個可變域(Vh),接著是多個恒定域。每條輕鏈在一端具有一個 可變域(化），而另一端是一個恒定域。輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而輕 鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變域之間 形成界面。
[0040] 抗體的"可變區(qū)"或"可變域"指抗體重鏈或輕鏈的氨基端結構域。重鏈的可變域可 W稱為"VH"。輕鏈的可變域可W稱為"VL"。運些結構域一般是抗體的最易變部分且包含抗 原結合位點。
[0041] 術語"可變的"指可變域中的某些部分在抗體間序列差異廣泛且用于每種特定抗 體對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。 它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區(qū)化VR)的S個區(qū)段。可變域中更加高度保守的部 分稱作框架區(qū)（FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR區(qū)，它們大多采取0-片層構 象，通過S個HVR連接，HVR形成連接0-片層結構的環(huán)且在有些情況中形成0-片層結構一部 分的。每條鏈中的HVR通過FR區(qū)非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的HVR-起促成抗體 的抗原結合位點的形成（參見Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,化tional Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定域不直接參 與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應器功能，諸如抗體在抗體依賴性細胞的毒性中的 參與。
[0042] 根據其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動物物種的抗體(免疫球蛋白）的"輕 鏈"可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(A)。
[0043] 根據其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白）可歸入不同的類。免疫球蛋 白有五大類：IgA, I神，I姐，IgG和IgM，其中有些可進一步分為亞類（同種型），例如IgGi， 1邑62，1邑63，1邑64，1邑41和1邑42。將與不同類的免疫球蛋白對應的重鏈恒定域分別稱作〇,5,6， 丫和y。不同類的免疫球蛋白的亞基結構和=維構造是眾所周知的，一般性描述于例如 At)bas et al.,Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)?？贵w 可W是抗體與一種或多種其它蛋白質或膚共價或非共價聯(lián)合而形成的更大融合分子的一 部分。
[0044]術語"全長抗體"，"完整抗體"和"完全抗體"在本文中可互換使用，指基本上完整 形式的抗體而非下文定義的抗體片段。該術語具體指重鏈包含Fc區(qū)的抗體。
[004引"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結合區(qū)。抗體片段的例子包 括化b，'，F(ab '）2和Fv片段;雙抗體(diabody);線性抗體;單鏈抗體分子;及由抗體片段 形成的多特異性抗體。
[0046] 用木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為"Fab"片段，各自具有 一個抗原結合位點，及一個剩余的"Fe"片段，其名稱反映了它易于結晶的能力。胃蛋白酶處 理產生一個F(ab '）2片段，它具有兩個抗原結合位點且仍能夠交聯(lián)抗原。
[0047] "Fv"是包含完整抗原結合位點的最小限度抗體片段。在一個實施方案中，雙鏈Fv 種類由緊密，非共價聯(lián)合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv (SCFv)種類中，一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域可W通過柔性膚接頭共價連接，使得輕 鏈和重鏈可W W與雙鏈Fv種類類似的"二聚體"結構聯(lián)合。正是在運種構造中，每個可變域 的S個HVR相互作用而在VH-化二聚體表面上限定了一個抗原結合位點。六個HVR-起賦予 抗體W抗原結合特異性。然而，即使是單個可變域(或是只包含對抗原特異性的S個HVR的 半個Fv)也具有識別和結合抗原的能力，只是親和力低于完整結合位點。
[0048] Fab片段包含重鏈和輕鏈可變域，而且還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域 (CHl) "Fab'片段與化b片段的不同之處在于重鏈CHl結構域的簇基末端增加了少數殘基，包 括來自抗體較鏈區(qū)的一個或多個半