。
[0034] 本發(fā)明使用紫外可見吸收光譜（UV-Vis)、熱重分析（TGA)、核磁共振氫譜（1H 匪R)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-OES)、Zeta電勢及動態(tài)光散射(DLS)和透射 電子顯微鏡(TEM)等方法表征制備的磁性納米顆粒，并通過CT成像儀測定納米金星的X射線 衰減系數(shù)，并評價了該納米材料作為光熱治療試劑在近紅外激光照射下的升溫效果，采用 凝膠阻滯實驗確定最佳氮磷比，利用CCK 8法來評價納米材料的細胞毒性，再利用熒光顯微 鏡、流式細胞儀、共聚焦顯微鏡來評價該納米材料的細胞吞噬量和胞內(nèi)定位，最后采用 Western Blot來評價VEGF siRNA介導的基因沉默效果。
[0035] 有益效果
[0036] (1)本發(fā)明采用種子生長法合成不規(guī)則分支狀的金納米星，然后通過巰基化的第 三代聚酰胺-胺樹狀大分子(G3.NH 2-SH)穩(wěn)定，繼而修飾聚乙二醇化的RGD，實現(xiàn)靶向，最后 與VEGF siRNA共同孵育，形成復合物;此法操作工藝簡單，反應條件溫和，易于操作純化，所 用均為環(huán)境友好的材料；
[0037] (2)本發(fā)明制備的RGD修飾樹狀大分子穩(wěn)定的功能化金納米星具有良好的水溶性、 膠體穩(wěn)定性、生物相容性和特定細胞的靶向性。體外實驗結果顯示該多功能化的金納米星 不僅具有很好的CT成像效果，同時可以把光熱治療和基因治療兩種治療模式集中在一個納 米平臺上，協(xié)同增強了對癌細胞和腫瘤的治療效果;可以預見，本發(fā)明制備的多功能化的金 納米星在分子影像、腫瘤的光熱治療和基因治療領域有著潛在的應用價值。
【附圖說明】
[0038] 圖1為實施例1中G3.NH2(a)和G3.NH2-SH(b)的核磁共振分析(1H NMR)圖；
[0039]圖2為實施例1中Au種子(a)和Au納米星(b)的紫外吸收圖譜；
[0040]圖3為實施例1中Au種子(a-b)和Au納米星(c-d)高分辨透射電鏡圖片；
[0041 ] 圖4為實施例2中AuNSs(a)和G3-AuNSs(b)的熱重分析圖；
[0042] 圖5為實施例3中⑶OH-PEG-RGD(a)和實施例4中Au-G3-PEG-RGD(b)的核磁共振分 析(1H NMR)圖；
[0043]圖6為實施例5中Au DSNSs納米材料在不同Au濃度下的CT成像圖和CT值隨金濃度 變化的線性關系圖；
[0044]圖7為實施例6中Au DSNSs在不同Au濃度下經(jīng)過近紅外激光照射后的升溫曲線圖； [0045] 圖8為實施例7中CCK8法測試的U87MG細胞經(jīng)過PBS緩沖液(對照）的AU-G3-PEG-RGD NSs和Au-G3-mPEG NSs(Au的實驗濃度范圍在O-ImM)處理24小時后的細胞存活率；
[0046] 圖9為實施例8中CCK8法測試的U87MG細胞在與本發(fā)明制備的Au DSNSs(Au濃度 0.2-0.8mM)共培養(yǎng)6小時后經(jīng)過激光照射細胞的存活率；
[0047]圖10為實施例9中Au DSNSs的凝膠阻滯實驗電泳圖譜；
[0048] 圖11為實施例10中Au DSNSs/siRNA復合物的電勢和水動力粒徑圖；
[0049] 圖12為實施例11中Au DSNSs與Cy3-siRNA復合物在不同N/P比例下吞噬量和處理 后細胞的平均熒光強度；
[0050] 圖13為實施例12中U87MG細胞分別經(jīng)過PBS緩沖液(a)、VEGF Cy3-siRNA和制備的 Au DSNSs/Cy3-siRNA復合物(N/P= 10，15，20，25)處理4小時后細胞的共聚焦顯微成像圖 片；圖14為實施例13中Au DSNSs在N/P = 20時，以PBS為對照，U87MG細胞的低ανβ3整合素表達 和高ανβ 3整合素表達對載體/Cy3_siRNA復合物的細胞吞噬量比較圖；
[0051 ] 圖15為實施例14中U87MG細胞分別經(jīng)過PBS，VEGF siRNA和Au DSNSs/siRNA復合物 處理后的Western Blot結果圖；
[0052]圖16為實施例15中CCK8法測試的U87MG細胞經(jīng)過PBS緩沖液，單獨的載體Au DSNSs，單獨的VEGF siRNA以及Au DSNSs/siRNA復合物處理48小時后，又經(jīng)近紅外激光照射 后的細胞存活率。
【具體實施方式】
[0053]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0054] 實施例1
[0055] (1)稱取IOmg G3.NH2溶解于20mL超純水中，并向其中加入3.25yL巰基乙酸甲酯 (Methylthioglycolate，95%，Mw = 106 · 14,P = 1 · 187)在60°C水浴反應2天，用截留分子量 為1000的透析袋在水中透析三天即得到部分琉基化的G3.NH2(G3.NH2-SH),凍干后儲存于-20 °C下備用。分別取3mg凍干的G3.順2和63. NH2-SH溶于氘代水中進行核磁測試，從圖1中可 以看出，63.順2-3!1(13)相較于63.順 2(&)，在3.25處出現(xiàn)了一個額外增強的吸收峰，為樹狀大 分子上的氨基和巰基乙酸甲酯發(fā)生反應生成的酰胺鍵的特征峰，并通過峰面積積分可知， 每一個G3. NH2上連接15.51個巰基。
[0056] (2)稱取IOOmg檸檬酸三鈉，溶解于9.9mL超純水中，待其充分溶解后取1.5mL加入 到沸騰的HAuCl4溶液（ImM，IOmL)中，在持續(xù)沸騰的情況下充分攪拌20分鐘，溶液顏色由無 色變?yōu)榫萍t色，得到檸檬酸鈉穩(wěn)定的金種子冷卻并儲存于4°C下備用。
[0057] (3)配制0.25mM HAuC 14溶液I OmL，充分攪拌狀態(tài)下加入10OyL步驟（2)中的金種 子，然后快速加入I OOyL AgNO3 (2mM)和50yL AA(O . ImM);待溶液變?yōu)樗{色后持續(xù)攪拌2小 時，反應結束后，離心純化，得到金納米星溶液。后按照金納米星與G3. NH2-SH的質量比為1: 5的比例，向金納米星溶液加入G3. NH2-SH的水溶液，攪拌反應24小時，離心，水洗三次，冷凍 干燥，得到的G3-AuNSs，純化凍干后儲存于-20 °C下備用。
[0058] 實施例2
[0059]分別取實施例1制備的Au種子和Au納米星的水溶液2mL離心管中，再向其中加700μ L超純水，超聲均勻，測量紫外吸收（見圖2，金種子和AuNSs在400到1000 nm的紫外吸收圖 譜）。紫外結果表明，金種子(a)的吸收峰在520nm左右，而采用種子生長法合成的金納米星 (b)的紫外吸收峰在SOOnm左右，說明成功合成了在近紅外區(qū)域具有獨特吸收峰的金納米 星。
[0060]分別取實施例1中制備的Au種子和Au納米星的水溶液5yL，然后用超純水配制成 IOOyL的納米顆粒懸浮液。并將納米顆粒懸浮液5yL滴在銅網(wǎng)表面，在空氣中晾干后用于TEM 測試(見圖3,金種子和金納米星的形貌和尺寸大?。８叻直媛蔜EM測試結果表明金種子(圖 3a-b)的形貌為球形，且分散均勻。分別隨機測量300個金種子的直徑，計算得到其直徑為 13.1±4.Onm;高分辨率TEM觀察本發(fā)明制備的金納米星（圖3c-d)形貌為分支狀的星形，平 均直徑大小為52.2±14.2nm〇
[0061 ] 為了檢測G3. NH2-SH在AuNSs (a)表面的上載量，對修飾前后的納米顆粒進行了 TGA 測試。由圖4可以看出，G3-AuNSs (b)在溫度升至900°C時，重量為原來的91.84%，即為金納 米星表面穩(wěn)定劑G3.NH2的重量，由此表明G3.NH2-SH已經(jīng)成功連接到金納米星的表面。
[0062] 實施例3
[0063] 將3.70mg 6-M與20mg NH2-PEG-⑶OH混合于5mL DMSO溶液中，攪拌反應10個小時， 得到C00H-PEG-6-M;然后將充分溶解于2mL DMSO中的6.91mg RGD逐滴加入到C00H-PEG-6-M 的DMSO溶液中，攪拌反應1天，用截留分子量1000的透析袋透析三天，然后冷凍干燥，即得 C00H-PEG-RGD。取3mg合成的COOH-PEG-R⑶溶