于氘代DMSO中進行核磁共振分析(1H NMR)(見 圖5a)。從圖中可以看出，在7.3和7.4ppm處出現(xiàn)的譜峰證明R⑶成功連接到PEG上，并通過峰 面積積分可知，每一個PEG上連接0.35個RGD。
[0064] 實施例4
[0065] 將實施例3中制備的25mg C00H-PEG-RGD、15.99mg EDC和9.60mg NHS混合溶解于 5mL DMSO后，攪拌活化4h;將實施例1中制備的G3-AuNSs用DMSO洗滌后，重新分散于IOmL DMSO中，然后將活化的C00H-PEG-RGD(5mL)溶液逐滴加入到G3-AuNSs(10mL)的DMSO溶液中， 攪拌反應(yīng)4天，再磁分離洗滌，即得Au-G3-PEG-RGD NSs，并分散于IOmL水中，同樣的方法合 成對照組材料Au-G3-mPEG NSs。為了檢測C00H-PEG-RGD在G3. NH2上的上載率，取3mg合成的 Au-G3-PEG-RGD NSs溶于氘代DMSO中進行核磁共振分析(1H NMR)(見圖5b)并通過峰面積積 分可知，每個G3. NH2上連接了 0.72個RGD。
[0066] 實施例5
[0067]在CT成像中，造影劑對X射線的衰減起重要作用。將實施例4制備的AU-G3-PEG-RGD NSs通過ICP-OES測試法測定溶液中Au元素的濃度，然后在EP管中用超純水配制Au濃度依次 為0.01、0.02、0.04、0.06和0.08mM的水溶液2mL用于評價其CT成像效應(yīng)。如圖6所示。結(jié)果表 明隨著金濃度的增加，納米顆粒的CT信號強度也隨之增加。并且從CT值隨金濃度變化的線 性擬合圖可以看出復(fù)合納米顆粒的CT值隨著金濃度的變化具有很好的線性關(guān)系。說明了本 發(fā)明的AU-G3-PEG-RGD NSs有望用作CT成像的造影劑。
[0068] 實施例6
[0069] 為了評價本發(fā)明制備的納米材料的在近紅外激光照射下的升溫效果，依據(jù)實施例 5測得的Au元素的濃度，在EP管中用超純水配制Au濃度依次為1、5、10、15和20mM的水溶液各 0.2mL，以等體積的水和金種子水溶液為對照，用808nm激光照射，觀察溫度變化情況(見圖 7)。結(jié)果表明水和金種子在照射后5分鐘，溫度僅稍微的升高。而對于Au-G3-PEG-RGD NSs， 隨著照射時間的延長，納米星水溶液的溫度明顯增加。而且隨著Au濃度的增加，溫度的增加 更加明顯。
[0070] 實施例7
[0071] 通過CCK8比色法來評價Au-G3-PEG-RGD NSs和Au-G3-mPEG NSs對細胞增殖的影 響。以U87MG細胞為靶向細胞評價實施例4制備的靶向組材料Au-G3-PEG-RGD NSs和對照組 材料Au-G3-mPEG NSs對細胞增殖的影響。用無菌PBS配置不同濃度的Au-G3-PEG-RGD NSs的 PBS溶液。U87MG細胞種植于96孔板分別與Au-G3-PEG-RGD NSs和Au-G3-mPEG NSs(Au濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mM)在37 °C下共培養(yǎng)24小時。然后換為新的培養(yǎng)液I OOyL，后加入10μ L CCK8，繼續(xù)在37°C下培養(yǎng)4小時后，在450nm處測量吸光值，并根據(jù)此值計算細胞的活力 (見圖8)，不同濃度的材料對細胞增殖的影響以緩沖液PBS為對照進行比較。與PBS對照組相 比，Au-G3-PEG-RGD NSs和Au-G3-mPEG NSs在Au的實驗濃度為0.2-0.8mM范圍內(nèi)對U87MG細 胞的存活率的影響沒有顯著性差異，細胞存活率均在80%以上。即使Au的實驗濃度達到 I .OmM，才顯示出較低的細胞毒性，這充分說明合成的Au-G3-PEG-RGD NSs和Au-G3-mPEG NSs均具有良好的生物相容性。
[0072] 實施例8
[0073]以U87MG細胞為模型細胞，在808nm激光照射下評價Au DSNSs對細胞的殺傷作用。 用無菌PBS配置不同濃度的Au DSNSs的PBS溶液。U87MG細胞與本發(fā)明制備的Au DSNSs(Au濃 度為0.2、0.4、0.6和0.8mM)共培養(yǎng)6小時后用808nm激光器照射5分鐘，未照射的細胞用作對 照組。然后，向培養(yǎng)板孔中加入IOyL CCK8，繼續(xù)在37°C下培養(yǎng)4小時后，在450nm處測量吸光 值，并根據(jù)此值計算細胞的活力（見圖9)。結(jié)果表明隨著濃度的增加，未照射的細胞仍然保 持很高的細胞存活率;而經(jīng)過激光照射5分鐘，細胞表現(xiàn)出凋亡趨勢，并且隨著金濃度的增 加，細胞的存活率越低。在材料濃度為〇. 8mM時，激光照射5分鐘，細胞存活率僅為40 %左右， 該實驗結(jié)果說明實施例4制備的Au DSNSs在近紅外激光照射下能引起細胞的凋亡。
[0074] 實施例9
[0075] 凝膠阻滯實驗用于表征載體對SiRNA的包裹能力，首先采用定氮試劑盒法測出本 發(fā)明制備的Au DSNSs的氨基數(shù)量，然后按照Au DSNSs與VEGF siRNA N/P分別為0.25,0.5， 1.0,2.0,3.0和4.0的比例進行孵育15-20分鐘，進行瓊脂糖凝膠電泳(見圖10)。實驗結(jié)果表 明實施例4所制備的Au-G3-PEG-RGD NSs可以在較低N/P(N/P = 2)下與VEGF siRNA很好復(fù) 合，將VEGF s iRNA完全阻滯，說明這種載體具有很好的s iRNA包裹能力。
[0076] 實施例10
[0077] 粒徑和表面電勢測試用于表征載體Au DSNSs攜帶VEGF siRNA的入胞能力。將實施 例4制備的Au DSNSs與5yL VEGF 8丨1?祖(103=1〇，15,2〇,25)復(fù)合后，終體積固定在1〇(^1^， 室溫下孵育20min，然后加入ImL的roS。采用馬爾文激光粒度儀(Malvern，MK，633nm激光)對 其粒徑和表面電勢進行了表征，結(jié)果如圖11所示。測量結(jié)果表明，Au DSNSs/siRNA復(fù)合物的 大小在合適轉(zhuǎn)染的尺寸范圍內(nèi)，且復(fù)合物電勢在N/P= 10,15,20時相差不大，都在適合轉(zhuǎn)染 的電勢范圍內(nèi)。
[0078] 實施例11
[0079] 通過流式細胞儀檢測制備的411〇3奶8/^73-8丨1?財?shù)?]871?；細胞吞噬效率。將2\ IO5個/孔U87MG細胞種植于12孔細胞培養(yǎng)板中，在37 °C和5 % CO2下培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁，然 后棄去培養(yǎng)基，將帶有Cy3標(biāo)記的VEGF siRNA與Au DSNSs按照不同的N/P復(fù)合(N/P= 10，15， 20,25)共同孵育15-20分鐘，用含有此復(fù)合物的DMEM培養(yǎng)液替換并在37°C和5%⑶2下與 U87MG細胞共培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)結(jié)束后用PBS清洗3次，再胰酶消化、離心、過濾，最后分散在 ImL PBS中，通過流式細胞儀檢測細胞的平均熒光強度(見圖12)。實驗結(jié)果表明，在N/P = 20 的時候，熒光強度最高，VEGF siRNA的傳遞效率最好。
[0080] 實施例12
[00811采用共聚焦顯微鏡來進一步探究Au DSNSs與Cy3-siRNA復(fù)合物在胞內(nèi)的定位及細 胞吞噬量。先將蓋玻片放置于12孔細胞培養(yǎng)板中并用DMEM培養(yǎng)基浸泡12h，然后每孔補充 l.OmL培養(yǎng)基并接種2X105個/孔U87MG細胞，培養(yǎng)一天。然后再將U87MG細胞分別與含有 卩85、8丨1?祖和本發(fā)明制備的41105吧8/^73-8丨1?熟0/?=10，15,20,25)的01^]\1培養(yǎng)液在371€ 和5%C02下共培養(yǎng)4小時。然后在油鏡下觀察細胞吞噬納米顆粒后的熒光信號(見圖13)。從 圖中可以看出，經(jīng)過PBS處理的細胞內(nèi)沒有熒光，經(jīng)過單獨的VEGF Cy3-siRNA轉(zhuǎn)染的細胞有 少量微弱的熒光，而經(jīng)過不同N/P的Au DSNSs與Cy3-siRNA復(fù)合物處理的細胞均顯示出了較 高的熒光強度，其中與流式細胞術(shù)結(jié)果相符。當(dāng)N/P = 20的時候，U87MG細胞內(nèi)的熒光強度最 強，基因傳遞效率最尚。
[0082] 實施例13
[0083]為了驗證RGD修飾的功能化金納米星對模型細胞U87MG具有靶向作用，自由RGD阻 斷實驗用于表征載體的靶向轉(zhuǎn)染能力，在U87MG細胞培養(yǎng)基中添加自由的RGD-SH來阻斷ανβ3 整合素的表達，使用Au DSNSs與Cy3-siRNA復(fù)合物分別轉(zhuǎn)染未經(jīng)處理的U87MG細胞和阻斷的 細胞。將自由的RGD-SH加入到U87MG細胞的培養(yǎng)基中，作用1-2小時，再加入I 3BSdiRNA和A