u DSNSs/Cy 3-s i RNA (N/P = 20)復(fù)合物與細(xì)胞共培養(yǎng)4h，隨后通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)復(fù)合物的熒 光強(qiáng)度，結(jié)果如圖14。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在N/P = 20的時(shí)候，未經(jīng)處理的U87MG細(xì)胞相較于阻斷 的細(xì)胞來說表現(xiàn)出較高的熒光強(qiáng)度，且二者相比具有顯著性差異，這也表明了 R⑶修飾的納 米材料對(duì)U87MG細(xì)胞具有較好的靶向作用。
[0084] 實(shí)施例14
[0085] 采用Western Blot來評(píng)價(jià)U87MG細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)情況，評(píng)估本發(fā)明合成的Au DSNSs作為基因治療載體的轉(zhuǎn)染效果。將U87MG細(xì)胞以5 X IO5個(gè)/孔種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板 中，在37°C和5%CO2下培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)基，加入PBS、siRNA和本發(fā)明制備的 Au DSNSs/siRNA(N/P = 20的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，裂解提取U87MG細(xì)胞總蛋白，后 將蛋白質(zhì)變性，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)，ECL化學(xué)發(fā)光，顯影，定 影，最終得到膠片圖（圖15) JBS作為空白對(duì)照，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)作為內(nèi)參蛋 白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)參蛋白GADPH的表達(dá)量在這三個(gè)實(shí)驗(yàn)組內(nèi)保持恒定，而目標(biāo)蛋白VEGF， 相較于空白對(duì)照組PBS處理的細(xì)胞表達(dá)量而言，單獨(dú)VEGF siRNA處理的細(xì)胞，VEGF蛋白表達(dá) 量沒有明顯變化，而經(jīng)Au DSNSs/siRNA處理的實(shí)驗(yàn)組，U87MG細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白表達(dá)量明顯減 少。這也證明了本發(fā)明合成的載體可以有效地?cái)y帶siRNA入胞，并且實(shí)現(xiàn)基因治療的目的。
[0086] 實(shí)施例15
[0087]為了驗(yàn)證本發(fā)明合成的Au DSNSs/siRNA納米材料具有光熱治療和基因治療的協(xié) 同聯(lián)合治療效果，將VEGF siRNA、Au DSNSs和Au DSNSs/siRNA三組材料與細(xì)胞共孵育后經(jīng) 近紅外激光照射，最后由CCK8比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率來評(píng)價(jià)納米材料的治療效果，PBS作為 空白對(duì)照。將U87MG細(xì)胞以I X IO4個(gè)/孔種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C和5%C02條件下培 養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)基，分別加入含有PBS、siRNA、Au DSNSs和Au DSNSs/siRNA (N/P = 20)的新DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48小時(shí)后，將孔板置于808nm的激光下分別照射5分鐘，未 經(jīng)照射的細(xì)胞作為對(duì)照組，由圖16可以看出，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)由Au DSNSs/siRNA復(fù)合物處理后，細(xì) 胞的存活率在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中最低，加之激光照射后，細(xì)胞存活率又顯著降低，達(dá)到22%左 右，從而說明Au DSNSs/siRNA可以將光熱治療和基因治療整合在一個(gè)納米平臺(tái)上，實(shí)現(xiàn)聯(lián) 合治療。
[0088] 上述實(shí)施例中siRNA和Cy3-siRNA兩種核酸形式，其中Cy3-siRNA為細(xì)胞色素 3標(biāo)記 的siRNA，類似于一種熒光色素，信息如表1所示：
[0089]表1siRNA 和 Cy3-siRNA 的信息
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種RGD修飾樹狀大分子穩(wěn)定的功能化金納米星/s iRNA復(fù)合物的制備方法，包括： (1) 將檸檬酸三鈉溶于超純水中，快速加入到煮沸的氯金酸溶液里，持續(xù)反應(yīng)，冷卻，得 到檸檬酸鈉穩(wěn)定的金納米顆粒;其中，檸檬酸三鈉與氯金酸溶液的體積比為1.5:10; (2) 將步驟（1)中的檸檬酸鈉穩(wěn)定的金納米顆粒加入到氯金酸溶液中，避光攪拌，加入 AgN03和抗壞血酸AA，攪拌反應(yīng)2~4h，純化，冷凍干燥，得到金納米星AuNSs ;其中，HAuCl4、 AA、AgN03 的摩爾比為 500:1:40 ~60; (3) 將過量的巰基乙酸甲酯MTG逐滴加入到第三代聚酰胺-胺樹狀大分子G3.NH2的超純 水溶液中，60°C~80°C恒溫反應(yīng)12~48h，透析，冷凍干燥，得到部分巰基封端的聚酰胺-胺 三代樹狀大分子G3. NH2-SH; (4) 將步驟(3)中的G3 . NH2-SH溶于超純水中，逐滴加入到步驟(2)中的AuNSs的水溶液 中，攪拌12~24h，離心，洗滌，冷凍干燥，得到樹狀大分子穩(wěn)定的金納米星G3-AuNSs;其中， G3 · NH2-SH與AuNSs的質(zhì)量比為5~10:1; (5) 將6-(馬來酰亞胺基）己酸琥珀酰亞胺酯6-M與COOH-PEG-NHdg合于DMSO溶液中，攪 拌反應(yīng)8-10小時(shí)，得到⑶0H-PEG-MAL;然后再將充分溶解于DMS0中的巰基封端的RGD即SH-RGD逐滴加入到⑶0H-PEG-MAL的DMS0溶液中，攪拌反應(yīng)1~2天，透析，冷凍干燥，即得到 C00H-PEG-RGD;其中，SH-RGD: 6-M: C00H-PEG-NH2 的摩爾比為 1:1 ~1.2:1 ~1.2; (6) 將步驟（5)中的C00H-PEG-R⑶經(jīng)過EDC和NHS活化，然后加入到步驟(4)中G3-AuNSs 的DMS0分散液中，攪拌反應(yīng)2~4天，離心，洗滌，冷凍干燥，得到Au-G3-PEG-RGD NSs，簡(jiǎn)稱Au DSNSs;其中，C00H-PEG-RGD與Au DSNSs中樹狀大分子的摩爾比為4~6:1; (7) 將步驟(6)中的Au DSNSs與VEGF siRNA共同孵育15-20分鐘，得到復(fù)合物Au DSNSs/ siRNA〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RGD修飾樹狀大分子穩(wěn)定的功能化金納米星/siRNA復(fù)合 物的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中煮沸的時(shí)間為15~20分鐘。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RGD修飾樹狀大分子穩(wěn)定的功能化金納米星/siRNA復(fù)合 物的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中檸檬酸鈉穩(wěn)定的金納米顆粒與氯金酸溶液的體 積比為1:100~125。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RGD修飾樹狀大分子穩(wěn)定的功能化金納米星/siRNA復(fù)合 物的制備方法，其特征在于，所述步驟⑶MTG與G3. NH2的摩爾比為18~20:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RGD修飾樹狀大分子穩(wěn)定的功能化金納米星/siRNA復(fù)合 物的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)和步驟(5)中透析為用截留分子量1000的透析袋 透析3天。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RGD修飾樹狀大分子穩(wěn)定的功能化金納米星/siRNA復(fù)合 物的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)中C00H-PEG-NH 2的分子量為2000。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RGD修飾樹狀大分子穩(wěn)定的功能化金納米星/siRNA復(fù)合 物的制備方法，其特征在于，所述步驟(6)中C00H-PEG-RGD、EDC和NHS的摩爾比為1:8~10:8 ~10〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RGD修飾樹狀大分子穩(wěn)定的功能化金納米星/siRNA復(fù)合 物的制備方法，其特征在于，所述步驟（6 )中活化時(shí)間為2~4 h ;離心的轉(zhuǎn)速為7 0 0 0 -8000rpm，時(shí)間為20min。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RGD修飾樹狀大分子穩(wěn)定的功能化金納米星/siRNA復(fù)合 物的制備方法，其特征在于，所述步驟(7)中VEGF s iRNA規(guī)格為100D。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種RGD修飾樹狀大分子穩(wěn)定的功能化金納米星/siRNA復(fù)合 物的制備方法，其特征在于，所述步驟(7)中Au DSNSs與VEGF siRNA的N/P為10:1~25:1。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種RGD修飾樹狀大分子穩(wěn)定的功能化金納米星/siRNA復(fù)合物的制備方法，包括：檸檬酸鈉還原法制備金納米顆粒，種子生長(zhǎng)法AuNSs；將過量的MTG滴加入到G3.NH2的溶液中，恒溫反應(yīng)得G3.NH2-SH，然后滴加入到AuNSs水溶液中，攪拌得G3-AuNSs；將6-M與COOH-PEG-NH2反應(yīng)得COOH-PEG-MAL；然后SH-RGD與COOH-PEG-MAL反應(yīng)得COOH-PEG-RGD，活化后加入到G3-AuNSs的DMSO分散液中，反應(yīng)得Au？DSNSs，與VEGF？siRNA共同孵育，即得。本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，工藝簡(jiǎn)單，易于操作，在診療一體化領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【IPC分類】B22F9/24, C12N15/87, B82Y40/00, A61K48/00, A61K49/00, A61K41/00, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105665736
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610018168
【發(fā)明人】沈明武, 韋平, 胡勇, 史向陽
【申請(qǐng)人】東華大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年1月12日