本發(fā)明涉及肌醇的制備方法，尤其涉及體外多酶催化將淀粉或纖維素以及它們的衍生物轉(zhuǎn)化為肌醇的方法，屬于肌醇的酶催化生產(chǎn)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肌醇又名環(huán)已六醇，是水溶性維生素B族中的一種。肌醇是人、動(dòng)物與微生物生長(zhǎng)的必需物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)。目前全球的需求量大概在每年5,000噸左右，由于目前肌醇的高售價(jià)，使得肌醇的市場(chǎng)前景還未得到充分的開(kāi)發(fā)，例如2013年全球飼料產(chǎn)量為9.6億噸，如果都加入0.2-0.5％的肌醇，那么飼料工業(yè)所需肌醇的產(chǎn)量應(yīng)該達(dá)到每年190-480萬(wàn)噸。在這種情況下，目前中國(guó)國(guó)內(nèi)，甚至全世界的產(chǎn)量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。

目前肌醇的生產(chǎn)主要還是傳統(tǒng)的高溫加壓水解植酸(六磷酸肌醇)。該工藝設(shè)備材質(zhì)要求嚴(yán)格，一次性投資大，操作壓力只能控制在一定的范圍內(nèi)，限制了原材料利用率的提高，且粗產(chǎn)品精制工藝復(fù)雜，損失較多，生產(chǎn)成本較高，而且該工藝會(huì)產(chǎn)生大量的磷酸污染物，對(duì)水源，環(huán)境污染嚴(yán)重。近些年，為了減少能耗和污染開(kāi)發(fā)了常壓水解法。目前研究肌醇生產(chǎn)的熱點(diǎn)在化學(xué)合成法和微生物酶解法，然而均不同程度的存在成本高、產(chǎn)率低等問(wèn)題。

因此，亟待開(kāi)發(fā)一種低成本，低污染，高產(chǎn)率的生產(chǎn)肌醇的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種肌醇的酶催化轉(zhuǎn)化方法，通過(guò)體外多酶催化淀粉或纖維素以及它們的衍生物和葡萄糖生產(chǎn)肌醇的方法，該方法具有肌醇產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率高，生產(chǎn)成本低，無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明首先公開(kāi)了一種肌醇的制備方法，包括以下步驟：

(1)以淀粉或淀粉衍生物為底物，加入葡聚糖磷酸化酶(α-Glucan phosphorylase，EC 2.4.1.1)，葡萄糖磷酸變位酶(Phosphoglucomutase，EC 5.4.2.2)，肌醇-3-磷酸合成酶(Inositol-3-phophate synthase，EC 5.5.1.4)和肌醇單磷酸酶(Inositol monophosphatase，EC 3.1.3.25)建立多酶反應(yīng)體系，進(jìn)行酶催化反應(yīng)；(2)將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化，即得。

其中，步驟(1)所述底物的濃度為10g/L；所述葡聚糖磷酸化酶的用量為0.05U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為1U/mL，所述肌醇-3-磷酸合成酶的用量為0.05U/mL，所述肌醇單磷酸酶的用量為2U/mL；所述酶催化反應(yīng)的條件是在40-80℃反應(yīng)10-100小時(shí)；優(yōu)選為，在60℃反應(yīng)40小時(shí)。

在所述多酶反應(yīng)體系中加入淀粉去分支酶和麥芽糖磷酸化酶(EC2.4.1.8)，或者，淀粉去分支酶和葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.25)，能夠有效提高肌醇的得率和轉(zhuǎn)化率；優(yōu)選的，所述淀粉去分支酶的用量為1U/mL，所述麥芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8)或葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的用量為1U/mL；其中，所述去分支酶為異淀粉酶(isoamylase，EC3.2.1.68)或普魯蘭酶(pullulanase，EC 3.2.1.41)中的任意一種或兩種；

更優(yōu)選的，所述底物的濃度為10g/L；所述葡聚糖磷酸化酶的用量為5U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為1U/mL，所述肌醇-3-磷酸合成酶的用量為5U/mL，所述肌醇單磷酸酶的用量為2U/mL，所述淀粉去分支酶的用量為1U/mL，所述麥芽糖磷酸化酶或葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的用量為1U/mL；

所述酶催化反應(yīng)在40-100℃反應(yīng)10-100小時(shí)；優(yōu)選的，所述酶催化反應(yīng)在40-80℃反應(yīng)40小時(shí)；最優(yōu)選的，所述酶催化反應(yīng)在80℃反應(yīng)40小時(shí)。

為了進(jìn)一步提高肌醇的得率，將冗余的葡萄糖轉(zhuǎn)化為肌醇，在所述多酶反應(yīng)體系中加入聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase，EC2.7.1.63)和聚磷酸鹽；優(yōu)選的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量為1U/mL，所述聚磷酸鹽的用量為10mM；其中，所述聚磷酸鹽優(yōu)選為聚磷酸鈉。

所述多酶反應(yīng)體系還含有以下各成分：緩沖液、無(wú)機(jī)磷酸根、二價(jià)鎂離子和鋅離子或錳離子；優(yōu)選的，各成分的用量為：緩沖液100mM，無(wú)機(jī)磷酸根10mM，二價(jià)鎂離子5mM，鋅離子或錳離子0.5mM；其中，所述緩沖液優(yōu)選為HEPES緩沖液，更優(yōu)選的，HEPES緩沖液的pH值7.2。

反應(yīng)結(jié)束后，殘余的淀粉殘?jiān)鼘⑹羌兊闹辨湹矸?，此時(shí)可加入少量的α淀粉酶(EC 3.2.1.1)促進(jìn)淀粉殘?jiān)乃猓M(jìn)一步提高肌醇的產(chǎn)量。優(yōu)選的，α淀粉酶的用量為0.1U/ml。

本發(fā)明以淀粉或淀粉衍生物為底物，加入葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸變位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，配制多酶反應(yīng)體系，多酶催化途徑包括：由葡聚糖磷酸化酶將淀粉或淀粉衍生物中的一個(gè)葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸；由葡萄糖磷酸變位酶將葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸；由肌醇-3-磷酸合成酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇-3-磷酸，由肌醇單磷酸酶將肌醇-3-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇。由于由肌醇-3-磷酸合成酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇-3-磷酸和由肌醇單磷酸酶將肌醇-3-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇的兩個(gè)酶催化反應(yīng)是不可逆反應(yīng)，所以該酶催化體系能夠得到很高的轉(zhuǎn)化率。而高得率和高轉(zhuǎn)化率可以大大降低最終肌醇的分離成本。

由于淀粉是直鏈淀粉(20-30％)和支鏈淀粉(70-80％)的混合物。支鏈淀粉中的支鏈?zhǔn)且驭?1,6糖苷鍵與主鏈相連的，而葡聚糖磷酸化酶并不能分解α-1,6糖苷鍵。為了提高肌醇的轉(zhuǎn)化率，本發(fā)明在多酶反應(yīng)體系中加入了能夠分解淀粉中α-1,6糖苷鍵的去分支酶—異淀粉酶或普魯蘭酶。由于葡聚糖磷酸化酶水解淀粉的最終產(chǎn)物是麥芽糖，為了利用麥芽糖， 本發(fā)明還在反應(yīng)體系中加入麥芽糖磷酸化酶，將麥芽糖分解為葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖；更優(yōu)選的，本發(fā)明在多酶反應(yīng)體系中再加入聚磷酸和聚磷酸葡萄糖激酶，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，由肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶轉(zhuǎn)化為肌醇，最終將淀粉及其衍生物中所有的葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為肌醇，從而提高肌醇的得率和轉(zhuǎn)化率。在這里，麥芽糖磷酸化酶可被葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(4-a-glucanotransferase，EC.2.4.1.25)替換，該酶可以將短鏈的寡聚糖聚合成為長(zhǎng)鏈的寡聚糖，而該長(zhǎng)鏈的寡聚糖又可被葡聚糖磷酸化酶重新利用，從而能夠提高淀粉的利用率。

本發(fā)明所述淀粉優(yōu)選為可溶性淀粉；所述淀粉衍生物包括部分水解淀粉、淀粉糊精、麥芽糊精、麥芽多糖或麥芽糖中的任意一種或多種。

本發(fā)明還公開(kāi)了另一種肌醇的制備方法，包括以下步驟：

(1)以纖維素或纖維素衍生物為底物，加入纖維素酶，纖維多糖磷酸化酶(cellodextrin phosphorylase，EC 2.4.1.49)、纖維二糖磷酸化酶(cellobiose phosphorylase，EC 2.4.1.20)、葡萄糖磷酸變位酶(EC 5.4.2.2)、肌醇-3-磷酸合成酶(EC 5.5.1.4)和肌醇單磷酸酶(EC 3.1.3.25)建立多酶反應(yīng)體系，進(jìn)行酶催化反應(yīng)；(2)將反應(yīng)產(chǎn)物分離、純化，即得。

本發(fā)明以纖維素為底物，加入纖維素酶，纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，配制多酶反應(yīng)體系，該多酶催化途徑包括：由纖維素酶水解纖維素生成纖維多糖和纖維二糖；由纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶將纖維多糖或纖維二糖的一個(gè)葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸；由葡萄糖磷酸變位酶將葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸；由肌醇-3-磷酸合成酶將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇-3-磷酸，由肌醇單磷酸酶將肌醇-3-磷酸轉(zhuǎn)化為肌醇。

其中，步驟(1)優(yōu)選為，先將10g/L纖維素或纖維素衍生物和5U/ml纖維素酶在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分鐘，然后4^oC離心，去上清，得到纖維素酶和纖維素的混合物；該處理能夠去除商業(yè)化纖維素酶中幾乎所有的葡萄糖苷酶，這樣可以避免葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成大量的葡萄糖，從而使主要的水解產(chǎn)物是纖維二糖和纖維多糖。

在多酶反應(yīng)體系中，所述纖維素酶和纖維素的混合物的濃度為10g/L；所述纖維多糖磷酸化酶的用量為5U/mL，所述纖維二糖磷酸化酶的用量為5U/mL，所述葡萄糖磷酸變位酶的用量為1U/mL，所述肌醇-3-磷酸合成酶的用量為5U/mL，所述肌醇單磷酸酶的用量為2U/mL；所述酶催化反應(yīng)是在20-100℃反應(yīng)10-100小時(shí)；優(yōu)選為，在40-80℃反應(yīng)72小時(shí)；最優(yōu)選為，在50℃反應(yīng)72小時(shí)。

為了進(jìn)一步提高肌醇的得率，步驟(1)中的多酶反應(yīng)體系加入聚磷酸葡萄糖激酶(EC 2.7.1.63)和聚磷酸鹽；優(yōu)選的，所述聚磷酸葡萄糖激酶的用量為5U/mL，所述聚磷酸鹽的用量為10mM；其中，所述聚磷酸鹽優(yōu)選為聚磷酸鈉。

為了提高酶催化反應(yīng)的效率和產(chǎn)品的收率，所述多酶反應(yīng)體系還含有 以下各成分：緩沖液、無(wú)機(jī)磷酸根、二價(jià)鎂離子和鋅離子或錳離子；優(yōu)選的，各成分的用量為：緩沖液100mM，無(wú)機(jī)磷酸根10mM，二價(jià)鎂離子5mM，鋅離子或錳離子0.5mM；其中，所述緩沖液優(yōu)選為100mM HEPES緩沖液；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述HEPES緩沖液的pH值是7.2。

本發(fā)明在多酶反應(yīng)體系中再加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸，將纖維素水解后的最終產(chǎn)物葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，再由肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶催化轉(zhuǎn)化為肌醇，最終將纖維素及其衍生物中所有的葡萄糖單元轉(zhuǎn)化為肌醇。

本發(fā)明所述纖維素衍生物包括纖維素經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的產(chǎn)物，纖維多糖或纖維二糖中的任意一種；

其中，纖維素預(yù)處理方法有多種，例如酸水解法、酶水解法、物理法等；本發(fā)明所述纖維素經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的產(chǎn)物，優(yōu)選為纖維素經(jīng)過(guò)濃磷酸處理后的產(chǎn)物。

本發(fā)明多酶反應(yīng)體系中的任何一種酶還可以為任何一種具有同等功能的酶所替換，優(yōu)選為通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造所獲得的具有同等功能的突變酶。

本發(fā)明體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇試驗(yàn)中，在一個(gè)反應(yīng)體系中，以可溶性淀粉為原料，加入葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸變位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，進(jìn)行催化反應(yīng)，最終肌醇的轉(zhuǎn)化率為16％。在上述反應(yīng)體系中另外加入異淀粉酶，麥芽糖磷酸化酶，聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸鈉，同時(shí)提高葡聚糖磷酸化酶和肌醇-3-磷酸合成酶的用量，最終肌醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到72％，轉(zhuǎn)化率顯著提高。

本發(fā)明體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇實(shí)驗(yàn)中，在一個(gè)反應(yīng)體系中，以微晶形的纖維素(Avicel)為底物，加入纖維素酶、纖維多糖磷酸化酶，纖維二糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸變位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，進(jìn)行催化反應(yīng)，最終肌醇的轉(zhuǎn)化率為14％；以重生的非晶形的纖維素為底物，加入纖維素酶、纖維多糖磷酸化酶，纖維二糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸變位酶，肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶，進(jìn)行催化反應(yīng)，最終肌醇的轉(zhuǎn)化率為48％。在上述反應(yīng)體系中另外加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸鈉，最終肌醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到65％，轉(zhuǎn)化率顯著提高。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明在一個(gè)多酶反應(yīng)體系中，以淀粉或纖維素以及它們的衍生物為原料，通過(guò)體外多酶催化轉(zhuǎn)化為肌醇，并通過(guò)過(guò)程優(yōu)化，添加能促進(jìn)淀粉或纖維素水解的酶以及利用副產(chǎn)物(葡萄糖)的酶，使轉(zhuǎn)化效率顯著提高，高得率和高轉(zhuǎn)化率又大大降低肌醇的分離成本。本發(fā)明方法具有簡(jiǎn)便，原料利用率高、肌醇產(chǎn)率高，生產(chǎn)成本低，污染低等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)肌醇的規(guī)?；a(chǎn)。

本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)及定義

除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。

術(shù)語(yǔ)“酶催化反應(yīng)”意指在生物催化劑-酶作用下進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)。

術(shù)語(yǔ)“葡萄糖多聚物”意指葡萄糖分子聚合而成的淀粉或纖維素。

術(shù)語(yǔ)“葡萄糖寡聚物”意指部分水解的淀粉、淀粉糊精、麥芽多糖、麥芽糖、纖維多糖或纖維二糖等。

附圖說(shuō)明

圖1為轉(zhuǎn)化淀粉生成肌醇的體外多酶催化途徑的示意圖；其中，IA，異淀粉酶；PA，普魯蘭酶；αGP，葡聚糖磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸變位酶；IPS，肌醇-3-磷酸合成酶；IMP，肌醇單磷酸酶；MP，麥芽糖磷酸化酶(該酶可被葡聚糖轉(zhuǎn)移酶替換)；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；

圖2為SDS-PAGE檢測(cè)4個(gè)關(guān)鍵酶；其中，第1列，葡聚糖磷酸化酶；第2列，葡萄糖磷酸變位酶；第3列，肌醇-3-磷酸合成酶；第4列，肌醇單磷酸酶；

圖3為利用HPLC分析肌醇；其中，圖3a為用HPLC方式區(qū)分肌醇、葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸；圖3b為用HPLC定量分析肌醇的濃度，通過(guò)肌醇峰的強(qiáng)度可以定量得到肌醇的濃度；

圖4為利用HPLC檢測(cè)以可溶性淀粉為底物，經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)后的產(chǎn)物，箭頭所指表示肌醇的特征峰；

圖5為利用HPLC檢測(cè)以麥芽糊精為底物，經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)后的產(chǎn)物，箭頭所指表示肌醇的特征峰；

圖6為轉(zhuǎn)化纖維素生成肌醇的體外多酶催化途徑的示意圖；其中，Cellulase，纖維素酶；CDP，纖維多糖磷酸化酶；CBP，纖維二糖磷酸化酶；PGM，葡萄糖磷酸變位酶；IPS，肌醇-3-磷酸合成酶；IMP，肌醇單磷酸酶；PPGK，聚磷酸葡萄糖激酶；

圖7為SDS-PAGE檢測(cè)轉(zhuǎn)化纖維素生成肌醇的2個(gè)關(guān)鍵酶；其中，第1列，纖維二糖磷酸化酶，第2列，纖維多糖磷酸化酶；

圖8為利用HPLC檢測(cè)以微晶形纖維素(Avicel)為底物，經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)后的產(chǎn)物，箭頭所指表示肌醇的特征峰。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)驗(yàn)材料

可溶性淀粉，soluble starch，ACROS公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)：424490020；

麥芽糊精，ALDRICH公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)419672；

pET20b載體，Novagen，Madison，WI；

大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；

本發(fā)明中的大部分酶(除了肌醇單磷酸酶，聚磷酸葡萄糖激酶和葡聚糖轉(zhuǎn)移酶)能在Sigma公司購(gòu)買得到；但是都可以按照基因工程方法通過(guò)原核表達(dá)獲得；

纖維素酶從Sigma公司購(gòu)買，產(chǎn)品編號(hào)為C2730；

麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購(gòu)買，產(chǎn)品編號(hào)為M8284；

α淀粉酶從Sigma公司購(gòu)買，產(chǎn)品編號(hào)為10065；

Avicel，微晶形纖維素，從Sigma公司購(gòu)買，產(chǎn)品編號(hào)為11365。

實(shí)驗(yàn)例1體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇

通過(guò)一個(gè)體外多酶催化體系將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇(圖1)。這些關(guān)鍵酶包括：(1)葡聚糖磷酸化酶(αGP，EC 2.4.1.1)，從淀粉上釋放出葡萄糖-1-磷酸；(2)葡萄糖磷酸變位酶(PGM，EC 5.4.2.2)，催化葡萄糖-1-磷酸到葡萄糖-6-磷酸；(3)肌醇-3-磷酸合成酶(IPS，EC 5.5.1.4)，其催化葡萄糖-6-磷酸為肌醇-3-磷酸；(4)肌醇單磷酸酶(IMP，EC 3.1.3.25)，其將肌醇-3-磷酸脫磷成為肌醇。由于最后兩個(gè)酶反應(yīng)是不可逆反應(yīng)，所以該酶催化體系能夠得到很高的轉(zhuǎn)化率。

在本發(fā)明中，葡聚糖磷酸化酶來(lái)源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的編號(hào)為TM1168，葡萄糖磷酸變位酶也來(lái)源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的編號(hào)為TM0769，肌醇-3-磷酸合成酶來(lái)源于Archaeoglobus fulgidus，基因在KEGG上的編號(hào)為AF1794，肌醇單磷酸酶也來(lái)源于Thermotoga maritima，基因在KEGG上的編號(hào)為TM1415，這些基因組DNA都可從ATCC的官方網(wǎng)站(www.atcc.org)上獲得。這四個(gè)基因分別用不同的引物從相應(yīng)的基因組DNA中通過(guò)PCR獲取，并通過(guò)Simple Cloning(You,C.,et al.(2012)."Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b載體((Novagen,Madison,WI)中，獲得相應(yīng)的表達(dá)載體pET20b-TmαGP，pET20b-AfIPS，pET20b-TmPGM和pET20b-TmIMP。這四個(gè)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)與純化，蛋白質(zhì)純化的結(jié)果如圖2所示。

在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無(wú)機(jī)磷酸根，5mM的二價(jià)鎂離子，0.5mM鋅離子，0.05U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，0.05U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的可溶性淀粉，在60℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個(gè)小時(shí)。

根據(jù)保持時(shí)間的不同，HPLC可以用來(lái)區(qū)分反應(yīng)液中的肌醇、葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸或葡萄糖-6-磷酸(圖3a)；并且可以對(duì)肌醇進(jìn)行定量，如圖3b所示，肌醇的濃度與HPLC中肌醇特征峰的強(qiáng)度是成正比的；HPLC的流動(dòng)相為5mM的稀硫酸。

反應(yīng)結(jié)束后，最終肌醇(圖4)的終濃度是1.6g/L，轉(zhuǎn)化率為16％。

實(shí)驗(yàn)例2體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇

葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1。

在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無(wú)機(jī)磷酸根，5mM的二價(jià)鎂離子，0.5mM鋅離子，0.05U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，0.05U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的可溶性淀粉，在40℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個(gè)小時(shí)。

反應(yīng)結(jié)束后，最終肌醇的終濃度是0.9g/L，轉(zhuǎn)化率為9％。

實(shí)驗(yàn)例3體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇

葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1。

在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無(wú)機(jī)磷酸根，5mM的二價(jià)鎂離子，0.5mM鋅離子，0.05U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，0.05U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的可溶性淀粉，在80℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個(gè)小時(shí)。

反應(yīng)結(jié)束后，最終肌醇的終濃度是3.6g/L，轉(zhuǎn)化率為36％。

實(shí)驗(yàn)例4通過(guò)過(guò)程優(yōu)化和添加促進(jìn)淀粉水解的酶，利用體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇

由于淀粉是有分支鏈，單純采用葡聚糖磷酸化酶并不能完全將淀粉水解，因?yàn)槠暇厶橇姿峄钢粫?huì)作用于α-1，4糖苷鍵，而分支鏈?zhǔn)且驭?1，6糖苷鍵與主鏈連接的。這需要加入異淀粉酶(isoamylase，EC 3.2.1.68)水解α-1，6糖苷鍵。最后，淀粉被這兩種酶水解的最終產(chǎn)物是麥芽糖和葡萄糖，為了將這些最終產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為肌醇，還需要加入麥芽糖磷酸化酶(maltose phosphorylase，EC 2.4.1.8)和聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphate glucokinase，EC 2.7.1.63)。

在本發(fā)明中，異淀粉酶來(lái)源于Sulfolobus tokodaii，基因在KEGG上的編號(hào)為ST0928，該菌株的基因組DNA是德國(guó)Albert-Ludwigs-Freiburg的Georg Fuchs教授友情提供。聚磷酸葡萄糖激酶來(lái)源于Thermobifida fusca，基因在KEGG上的編號(hào)為Tfu1811，該菌株的基因組 DNA是美國(guó)康奈爾大學(xué)的David Wilson教授友情提供。葡聚糖轉(zhuǎn)移酶來(lái)源于Thermococcus litoralis，基因在KEGG上的編號(hào)為OCC_10078，該菌株的基因組DNA可從ATCC的官方網(wǎng)站(www.atcc.org)上獲得。這三個(gè)基因分別用不同的引物從相應(yīng)的基因組DNA中通過(guò)PCR獲取，并通過(guò)Simple Cloning(You,C.,et al.(2012)."Simple Cloning via Direct Transformation of PCR Product(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillus subtilis."Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-1595.)的方法克隆至pET20b載體中，獲得相應(yīng)的表達(dá)載體pET20b-StIA，pET20b-TfuPPGK和pET20b-Ti4GT，這三個(gè)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)中，并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)與純化。

葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購(gòu)買，產(chǎn)品編號(hào)為M8284。

在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無(wú)機(jī)磷酸根，5mM的二價(jià)鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，1U/mL的異淀粉酶，1U/mL的麥芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸鈉，10g/L的可溶性淀粉，在80℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個(gè)小時(shí)。最終肌醇(圖4)的終濃度為7.2g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了72％。

實(shí)驗(yàn)例5通過(guò)過(guò)程優(yōu)化和添加促進(jìn)淀粉水解的酶，利用體外多酶催化將淀粉轉(zhuǎn)化為肌醇

葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；聚磷酸葡萄糖激酶的制備同實(shí)驗(yàn)例4，普魯蘭酶(pullulanase，EC 3.2.1.41)從Sigma公司購(gòu)買，產(chǎn)品編號(hào)為P1067；麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購(gòu)買，產(chǎn)品編號(hào)為M8284。

由于從sigma公司購(gòu)買的普魯蘭酶不能在高溫(80℃)下反應(yīng)，因此先在37℃用普魯蘭酶處理可溶性淀粉，隨后再加入其他的酶，再在80℃反應(yīng)。

在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無(wú)機(jī)磷酸根，5mM的二價(jià)鎂離子，0.5mM鋅離子，1U/mL的普魯蘭酶，10mM聚磷酸鈉，10g/L的可溶性淀粉，在37℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)10個(gè)小時(shí)后加入5U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，1U/mL的麥芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，在80℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個(gè)小時(shí)。最終肌醇(圖4)的終濃度為7.3g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了73％。

隨后在反應(yīng)體系中加入少量的α淀粉酶促進(jìn)殘?jiān)矸鄣乃?，提高肌醇的產(chǎn)量，α淀粉酶的用量為0.1U/ml，反應(yīng)先在37℃反應(yīng)6小時(shí)，隨后 繼續(xù)在80℃反應(yīng)24小時(shí)，最終肌醇(圖4)的終濃度為8.8g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了88％。

實(shí)驗(yàn)例6體外多酶催化將麥芽糊精轉(zhuǎn)化為肌醇

葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；異淀粉酶、聚磷酸葡萄糖激酶的制備同實(shí)驗(yàn)例4，麥芽糖磷酸化酶從Sigma公司購(gòu)買，產(chǎn)品編號(hào)為M8284；

在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無(wú)機(jī)磷酸根，5mM的二價(jià)鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的葡聚糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，1U/mL的異淀粉酶，1U/mL的麥芽糖磷酸化酶，1U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸鈉，10g/L的麥芽糊精(ALDRICH公司產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)419672)，在80℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)40個(gè)小時(shí)。最終肌醇(圖5)的終濃度為7.8g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了78％。

實(shí)驗(yàn)例7體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇

通過(guò)一個(gè)體外多酶催化體系將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇的示意圖見(jiàn)圖6。

纖維素酶是來(lái)自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1。

纖維多糖磷酸化酶(Cthe_2989)和纖維二糖磷酸化酶(Cthe_0275)都是來(lái)源于Clostridium thermocellum。這兩個(gè)基因分別用不同的引物從相應(yīng)的基因組DNA(基因組DNA可從ATCC的官方網(wǎng)站(www.atcc.org/)上獲得)中通過(guò)PCR獲取，并通過(guò)Simple Cloning(You,C.,et al.(2012))的方法克隆至pET20b載體中，獲得相應(yīng)的表達(dá)載體pET20b-CthCDP和pET20b-CthCBP。這兩個(gè)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌BL21(DE3)中，并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)與純化，蛋白質(zhì)純化的結(jié)果如圖7所示。

本實(shí)驗(yàn)采用微晶形纖維素(Avicel)為底物。首先將商業(yè)化的纖維素酶(5U/ml)和纖維素(10g/L)在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分鐘，在4℃離心，去上清。沉淀為纖維素和能與纖維素結(jié)合的纖維素酶的混合物。該處理能夠去除商業(yè)化纖維素酶中幾乎所有的葡萄糖苷酶，這樣可以避免葡萄糖苷酶水解纖維二糖生成大量的葡萄糖，從而使主要的水解產(chǎn)物是纖維二糖和纖維多糖。

在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無(wú)機(jī)磷酸根，5mM的二價(jià)鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的纖維多糖磷酸化酶，5U/mL纖維二糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的如上所述的纖維素和纖維素酶的混合物，在50℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個(gè)小時(shí)。最終肌醇的終濃度是1.4g/L，轉(zhuǎn)化率為14％，如圖8所示。

實(shí)驗(yàn)例8體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇

纖維素酶是來(lái)自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶、肌醇單磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；纖維多糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶的制備同實(shí)驗(yàn)例7。

本實(shí)驗(yàn)采用重生的非晶形的纖維素(Regenerated Amorphous cellulose(RAC)，這是Avicel經(jīng)過(guò)濃磷酸處理后的產(chǎn)物)(Zhang,Y.H.P.,et al.(2006)."A Transition from Cellulose Swelling to Cellulose Dissolution by o-Phosphoric Acid:Evidence from Enzymatic Hydrolysis and Supramolecular Structure."Biomacromolecules 7(2):644-648.)為底物。首先將商業(yè)化的纖維素酶(5U/ml)和該纖維素(10g/L)在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分鐘，在4℃離心，去上清。沉淀為纖維素和能與纖維素結(jié)合的纖維素酶的混合物。

在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無(wú)機(jī)磷酸根，5mM的二價(jià)鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的纖維多糖磷酸化酶，5U/mL纖維二糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的如上所述的纖維素和纖維素酶的混合物，在50℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個(gè)小時(shí)。最終肌醇的終濃度是4.8g/L，轉(zhuǎn)化率為48％。

實(shí)驗(yàn)例9體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇

纖維素酶是來(lái)自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶、肌醇單磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；纖維多糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶的制備同實(shí)驗(yàn)例7。

在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無(wú)機(jī)磷酸根，5mM的二價(jià)鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的纖維多糖磷酸化酶，5U/mL纖維二糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的如實(shí)驗(yàn)例8的纖維素和纖維素酶的混合物，在40℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個(gè)小時(shí)。最終肌醇的終濃度是2.3g/L，轉(zhuǎn)化率為23％。

實(shí)驗(yàn)例10體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇

纖維素酶是來(lái)自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶、肌醇單磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；纖維多糖磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶的制備同實(shí)驗(yàn)例7。

在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無(wú)機(jī)磷酸根，5mM的二價(jià)鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的纖維多糖磷酸化酶，5U/mL纖維二糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的 如實(shí)驗(yàn)例8的纖維素和纖維素酶的混合物，在80℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個(gè)小時(shí)。最終肌醇的終濃度是1.9g/L，轉(zhuǎn)化率為19％。

實(shí)驗(yàn)例11體外多酶催化將纖維素轉(zhuǎn)化為肌醇

由于纖維素水解后的最終產(chǎn)物為葡萄糖，為了將其轉(zhuǎn)化為肌醇，還需要加入聚磷酸葡萄糖激酶和聚磷酸。

纖維素酶是來(lái)自于Sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為C2730；葡萄糖磷酸變位酶、肌醇-3-磷酸合成酶和肌醇單磷酸酶的制備同實(shí)驗(yàn)例1；聚磷酸葡萄糖激酶的制備同實(shí)驗(yàn)例4；纖維多糖磷酸化酶、纖維二糖磷酸化酶的制備同實(shí)驗(yàn)例7。

在一個(gè)0.75毫升的反應(yīng)體系中含有100mM的HEPES緩沖液(pH7.2)，10mM的無(wú)機(jī)磷酸根，5mM的二價(jià)鎂離子，0.5mM鋅離子，5U/mL的纖維多糖磷酸化酶，5U/mL纖維二糖磷酸化酶，1U/mL的葡萄糖磷酸變位酶，5U/mL肌醇-3-磷酸合成酶和2U/mL的肌醇單磷酸酶，10g/L的如實(shí)驗(yàn)例8的纖維素和纖維素酶的混合物，5U/mL的聚磷酸葡萄糖激酶，10mM聚磷酸鈉，在50℃進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)72個(gè)小時(shí)。最終肌醇(圖8)的終濃度為6.5g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了65％。