本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領域，具體地說，涉及一種提高乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌活性的發(fā)酵方法。
背景技術：
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一類能在可利用的碳水化合物發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量乳酸的細菌。大多數(shù)乳酸菌是兼性厭氧菌或微需氧菌，不運動也不形成芽孢，它們在人和動物體內(nèi)是一類重要的微生物。主要定居在嘴、鼻、消化道、腸道和陰道黏膜中。在這些黏膜環(huán)境中，它們不僅不致病，相反還有益于健康，可以抑制一些腐敗菌和病原菌，從而維持體內(nèi)環(huán)境尤其是腸道內(nèi)正常微生態(tài)平衡。益生乳酸菌被公認為安全的(generallyrecognized as safe,GRAS)微生物。干酪乳桿菌是重要的益生菌，無論在食品發(fā)酵，還是工業(yè)乳酸發(fā)酵以及醫(yī)療保健領域，乳桿菌都被廣泛應用。益生乳酸菌制品可產(chǎn)生非特異性免疫調(diào)節(jié)因子，提高動物的免疫力。研究表明，直接飼喂益生乳酸菌可提高集體的抗體水平，產(chǎn)生干擾素，提高免疫球蛋白濃度和巨噬細胞的活性，增強機體免疫功能和抗病能力。
現(xiàn)有技術對于乳酸菌代謝途徑還不清楚，而且其代謝產(chǎn)物對大腸桿菌亦或是金黃色葡萄球菌的抑菌效果不強，主要原因在于菌體數(shù)量達不到理想效果，因此抑菌活性有待提高。
技術實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種提高乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌活性的發(fā)酵方法。
為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種提高乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌活性的發(fā)酵方法，所述方法為：在乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入胃 蛋白酶。
作為優(yōu)選，所述胃蛋白酶的加入量為1g/L～1.8g/L。
進一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下含量的成分：8-10g/L酪蛋白胨、8-10g/L牛肉膏、4-5g/L酵母粉、15-20g/L葡萄糖、1-2g/L檸檬酸二銨、5-6g/L乙酸鈉、2-3g/L K2HPO4、1-2mL/L吐溫80、0.5-0.58g/L MgSO4·7H2O、0.2-0.25g/L MnSO4·4H2O。
作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.5～7.0。
本發(fā)明還提供了一種提高乳酸菌代謝產(chǎn)物抑菌活性的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下含量的成分：10g/L酪蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、2g/L檸檬酸二銨、5g/L乙酸鈉、2g/L K2HPO4、1mL/L吐溫80、0.58g/L MgSO4·7H2O、0.25g/L MnSO4·4H2O、1g/L～1.8g/L胃蛋白酶。
進一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為：將酪蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、檸檬酸二銨、乙酸鈉、K2HPO4、吐溫80、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、1g/L～1.8g/L胃蛋白酶溶解于蒸餾水中，得到10g/L酪蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、2g/L檸檬酸二銨、5g/L乙酸鈉、2g/L K2HPO4、1mL/L吐溫80、0.58g/L MgSO4·7H2O、0.25g/L MnSO4·4H2O、1g/L～1.8g/L胃蛋白酶的培養(yǎng)基；用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7，115℃滅菌20min，貯存?zhèn)溆谩?/p>
需要說明的是，本發(fā)明的有益效果取決于培養(yǎng)基本身，與乳酸菌無關。因此，所使用的乳酸菌可為現(xiàn)有技術中的任意乳酸菌。在本發(fā)明的具體實施方式中，所述乳酸菌為發(fā)明人參考文獻《乳酸制品中乳酸菌分離篩選方法研究》(淮海工學院學報，作者王淑軍、韋友共、潘元兵)披露的方法在乳酸制品中分離得到。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明通過在培養(yǎng)基中添加適量的胃蛋白酶，使得乳酸菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物的抑菌活性得到顯著提高。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例1
1、原料
8g酪蛋白胨、8g牛肉膏、4g酵母粉、15g葡萄糖、1g檸檬酸二銨、5g乙酸鈉、2g K2HPO4、1mL吐溫80、0.5g MgSO4·7H2O、0.2g MnSO4·4H2O、蒸餾水。
2、制備方法
將酪蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、檸檬酸二銨、乙酸鈉、K2HPO4、吐溫80、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O溶解到蒸餾水中，得到含有8g/L酪蛋白胨、8g/L牛肉膏、4g/L酵母粉、15g/L葡萄糖、1g/L檸檬酸二銨、5g/L乙酸鈉、2g/L K2HPO4、1mL/L吐溫80、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.2g/L MnSO4·4H2O的培養(yǎng)基。
按上述配方配置好后，將其pH值用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至7，棉塞封口包扎，115℃滅菌20min。
實施例2
1、原料
10g酪蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母粉、20g葡萄糖、2g檸檬酸二銨、6g乙酸鈉、3g K2HPO4、2mL吐溫80、0.58g MgSO4·7H2O、0.25g MnSO4·4H2O、蒸餾水。
2、制備方法
將酪蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、檸檬酸二銨、乙酸鈉、K2HPO4、吐溫80、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O溶解于蒸餾水中，得到含有10g/L酪蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、2g/L檸檬酸二銨、6g/L乙酸鈉、3g/L K2HPO4、2mL/L吐溫80、0.58g/L MgSO4·7H2O、0.25g/L MnSO4·4H2O的培養(yǎng)基。
按上述配方配置好后，將其pH值用氫氧化鈉調(diào)節(jié)至6.5，然后 115℃滅菌20min。
實施例3
將乳酸菌以4％的接種量接種于實施例1所制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃下靜止培養(yǎng)16-18h即可檢測菌濃。
所述乳酸菌為發(fā)明人參考文獻《乳酸制品中乳酸菌分離篩選方法研究》(淮海工學院學報，作者王淑軍、韋友共、潘元兵)披露的方法在乳酸制品中分離得到。
檢測平板的制備：將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌兩種致病菌種接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫箱培養(yǎng)12h后，用無菌生理鹽水稀釋成致病菌菌液備用，濃度約為105cfu/mL。用微量移液槍取致病菌液0.1mL置于制備好的營養(yǎng)瓊脂檢測平板內(nèi)，用無菌玻璃涂棒將指示菌液在平板上涂布均勻，37℃恒溫干燥20min以固定菌液，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，取出后即可進行抑菌試驗。
發(fā)酵液平板的檢測：
采用牛津杯法進行抑菌試驗。用鑷子夾取無菌牛津杯輕輕放入檢測平板培養(yǎng)皿中，在水平放置的平皿中均勻放置4只牛津杯。吸取乳酸菌上清液0.2mL至牛津杯中(注意不要將上清液溢出杯外)。每種致病菌分別做3個重復樣，1個對照樣，對照樣只加液體MRS。然后將加好上清液的培養(yǎng)皿正面放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈，測抑菌圈直徑。
檢測結果見表1。
對比例1
本對比例實驗方法同實施例3，區(qū)別在于，本對比例所使用的發(fā)酵培養(yǎng)基未添加胃蛋白酶。
檢測結果見表1。
表1加有胃蛋白酶的抑菌效果
通過對抑菌直徑的測定，可計算得出加有胃蛋白酶的培養(yǎng)基中菌體個數(shù)為5.6×109cfu/mL。未加入胃蛋白酶的對照組菌濃為4.5～5×106cfu/mL。
可見，通過在培養(yǎng)基中添加適量的胃蛋白酶，能夠使得乳酸菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物的抑菌活性得到顯著提高。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。