本發(fā)明所涉及的是一種特異檢測Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒及其檢測方法，屬于病毒核酸檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：禽腺病毒(FowlAdenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，根據(jù)其群特異性抗原的不同，禽腺病毒可分為3群：Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群。Ⅰ群禽腺病毒主要從雞、火雞、鵝及其他禽類獲得，分為5個(gè)種(A-E)，每個(gè)種內(nèi)的病毒主要根據(jù)交叉中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步分為12個(gè)血清型(FAdV1-12)，它們有共同的群抗原。Ⅰ群禽腺病毒主要引起包涵體肝炎、心包積水綜合征等，發(fā)病率高，死亡率高，2015-2016年我國較多省份爆發(fā)了該病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，該病既可水平傳播，也可垂直傳播，給該病的防控帶來了巨大的挑戰(zhàn)，因此建立快速、敏感和特異的診斷方法和試劑盒是防控該病的關(guān)鍵。目前，檢測Ⅰ群禽腺病毒的診斷方法有病毒分離、電鏡觀察、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和ELISA等，這些傳統(tǒng)方法費(fèi)時(shí)、繁瑣，使得該病不能得到及時(shí)診斷，從而影響了該病的流行病學(xué)監(jiān)測和凈化，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。六鄰體hexon是禽腺病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，帶有主要屬和亞屬特異性抗原決定簇以及次要種特異性抗原決定簇，是中和抗體的靶目標(biāo)和主要保護(hù)性抗原基因，與致病性密切相關(guān)，因此作為診斷抗原具有良好的應(yīng)用前景。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，建立一種特異檢測Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明在GenBank選擇23株Ⅰ群禽腺病毒Hexon基因全/部分序列，涵蓋Ⅰ群禽腺病毒的12個(gè)血清型(FAdV1-12)，把這23株序列用ClustalX軟件進(jìn)行比對分析，尋找最為保守的區(qū)域，作為引物設(shè)計(jì)區(qū)域，并用兼并堿基Y代表C和T、K代表G和T、W代表A和T，最終設(shè)計(jì)并合成1對兼并引物，并以該引物為核心組裝了一種用于檢測Ⅰ群禽腺病毒的PCR試劑盒。該試劑盒具有使用方便、檢測準(zhǔn)確等特點(diǎn)，對該病的流行病學(xué)調(diào)查及防控具有重要意義。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題而采取的技術(shù)方案為：一種特異檢測Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括：Ⅰ群禽腺病毒PCR反應(yīng)液、10×PCRbufferforUNGplus、熱啟動型DNA聚合酶(HotStarTaqDNAPolymerase)、dUplusdNTPmix(dUTP、dATP、dGTP、dCTP的混合物)、尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品；其中，所述Ⅰ群禽腺病毒PCR反應(yīng)液包括：(1)濃度為5μM的上游引物，其序列為5‘-ATGGCCAAYTTCATGCCCATGG-3’，(2)濃度為5μM的下游引物，其序列為5‘-GTGGAAGTACTGWCKGTCGGGCCAG-3’。其中，所述的尿嘧啶DNA糖基化酶主要用于防止PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。PCR反應(yīng)中加入的UNG酶能選擇性斷裂單鏈和雙鏈DNA中U堿基的糖苷鍵，降解反應(yīng)體系中含U的DNA，有效消除PCR產(chǎn)物的殘留污染，大大降低擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的假陽性。按上述方案，優(yōu)選地，所述陽性質(zhì)控品為含有目的基因片段的質(zhì)粒,其由下述方法提取得到:將Ⅰ群禽腺病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株在CEK細(xì)胞上傳代增殖,-40℃/常溫條件下凍融2次，然后6000r/min，離心10min，取上清提取DNA。按上述方案，優(yōu)選地，所述陰性質(zhì)控品為從健康且無病原的雞只組織提取的DNA,具體提取方法如下:采集健康且無病原的雞只組織，按質(zhì)量體積比1g：10mL加入含1％雙抗的PBS，充分勻漿破碎，-40℃/常溫條件下凍融2次，然后6000r/min，離心10min，去除沉淀，取上清提取DNA所得。其中，所述雞只組織包括但不限于雞的肝臟、心臟等組織。按上述方案，優(yōu)選地，所述檢測試劑盒中各種試劑的含量為：本發(fā)明還提供上述的特異檢測Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，步驟具體為：1)配制PCR反應(yīng)體系：分別配制待檢樣品DNA模板、陽性對照、陰性對照的PCR反應(yīng)體系，具體如下：取待檢樣品DNA模板、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各1.0μL，各加入所述10×PCRbufferforUNGplus5μL、熱啟動型DNA聚合酶0.25μL、dUplusdNTPmix4μL、Ⅰ群禽腺病毒PCR反應(yīng)液2μL和尿嘧啶DNA糖基化酶0.5μL，再各用滅菌ddH2O補(bǔ)足至50μL，分別得待檢樣品DNA模板的PCR反應(yīng)體系、陽性對照的PCR反應(yīng)體系和陰性對照的PCR反應(yīng)體系；2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)結(jié)果判定。按上述方案，優(yōu)選地，步驟1)中所述待檢樣品DNA模板由下述方法提取得到：取待檢組織樣品0.1g，加入含1％雙抗的PBS1mL，勻漿15min，-40℃/常溫條件下反復(fù)凍融兩次，6000r/min，離心10min，取上清，提取DNA，得待檢樣品DNA模板。其中，待檢組織樣品包括但不限于雞、火雞、鵝及其它禽類的肝臟、心臟等組織。按上述方案，優(yōu)選地，步驟2)中所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行條件為：25℃UNG處理10min，95℃預(yù)變性2min；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。按上述方案，優(yōu)選地，步驟2)中所述結(jié)果判定方法如下：電泳紫外燈下觀察，陽性對照有一條530bp的清晰條帶，陰性對照無條帶；若待檢樣品電泳紫外燈下觀察出現(xiàn)大小約為530bp的條帶，即為陽性，表明該樣品含有該病毒；若待檢樣品紫外燈下觀察無條帶，則為陰性，表明該樣品不含該病毒。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明的試劑盒特異性強(qiáng)。該試劑盒的引物在設(shè)計(jì)時(shí)所選Hexon基因序列涵蓋Ⅰ群禽腺病毒的12個(gè)血清型(FAdV1-12)，并且引入合適數(shù)量的兼并堿基，同時(shí)試劑盒含有防污染試劑，并以dUTP代替?zhèn)鹘y(tǒng)的dTTP，形成了含dU堿基的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從而保證特異且準(zhǔn)確地檢測Ⅰ群禽腺病毒的1-12個(gè)血清型，為Ⅰ群禽腺病毒病的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了一種有效手段。2、本發(fā)明的試劑盒具有靈敏度高(稀釋到1:105仍然為陽性)、重復(fù)性好的特點(diǎn)，且操作簡單、方便快捷，適合Ⅰ群禽腺病毒病的早期診斷，能夠及時(shí)滿足疾病防控的需求。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒敏感性檢測的結(jié)果。圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒特異性檢測的結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒組成與配制1、試劑組成禽腺病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株購自中國獸藥監(jiān)察所；10×PCRbufferforUNGplus、HotStarTaqDNAPolymerase(5U/μL)、UNG(5U/μL)和dUplusdNTPmix(12.5×)購自TaKaRa公司，將dUplusdNTPmix(12.5×)稀釋12.5倍后得到dUplusdNTPmix；引物由上海生物工程公司合成；ddH2O為本實(shí)驗(yàn)室自制。2、引物設(shè)計(jì)與合成：在GenBank選擇23株Ⅰ群禽腺病毒Hexon基因全/部分序列，涵蓋Ⅰ群禽腺病毒的12個(gè)血清型(FAdV1-12)，把這23株序列用ClustalX軟件進(jìn)行比對分析，尋找最為保守的區(qū)域，作為引物設(shè)計(jì)區(qū)域，并用兼并堿基Y代表C和T、K代表G和T、W代表A和T，最終設(shè)計(jì)并合成1對兼并引物。上游引物序列為5‘-ATGGCCAAYTTCATGCCCATGG-3’，下游引物序列為：5‘-GTGGAAGTACTGWCKGTCGGGCCAG-3’。3、Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒，包括4、試劑配制(1)Ⅰ群禽腺病毒PCR反應(yīng)液的制備：分別將0.002μmol的上游引物(序列為5‘-ATGGCCAAYTTCATGCCCATGG-3’)和0.002μmol的下游引物(5‘-GTGGAAGTACTGWCKGTCGGGCCAG-3’)各自加入到200μL滅菌的ddH2O中，混合，配制成400μL的Ⅰ群禽腺病毒PCR反應(yīng)液，其中所述上游引物和下游引物的終濃度均為5μM；(2)陽性質(zhì)控品的制備：Ⅰ群禽腺病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株(毒株編號AV211)在CEK細(xì)胞上傳代增殖,-40℃/常溫條件下凍融2次，然后6000r/min，離心10min，取上清提取DNA,即含有目的基因片段的質(zhì)粒；(3)陰性質(zhì)控品的制備：采集健康且無病原的雞只心臟、肝臟等組織，按質(zhì)量體積比1g：10mL加入含1％雙抗的PBS，充分勻漿破碎，-40℃/常溫條件下凍融2次，然后6000r/min，離心10min，去除沉淀，取上清提取DNA所得；(4)自備試劑：滅菌的雙蒸水ddH2O。實(shí)施例2實(shí)施例1配制的Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒的使用方法，具體步驟如下：1)樣品處理：將收集到的待檢樣品的肝臟、心臟等組織0.1g，加入含1％雙抗的PBS1mL勻漿15min，-40℃/常溫條件下反復(fù)凍融兩次，6000r/min，離心10min，取上清待檢；2)待檢樣品DNA提?。喝〔襟E1)處理的待檢樣品上清，提取DNA，作為待檢樣品DNA模板；3)配制PCR反應(yīng)體系：取陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、步驟2)得到的待檢樣品DNA模板各1.0μL分別加入不同的PCR反應(yīng)管中，并向各管加入10×PCRbufferforUNGplus5μL、HotStarPowerTaqDNAPolymerase0.25μL、dUplusdNTPmix4μL、Ⅰ群禽腺病毒PCR反應(yīng)液2μL和UNG0.5μL，最后加滅菌ddH2O補(bǔ)至50μL，混勻；4)PCR擴(kuò)增：將步驟3)配成的反應(yīng)體系分別按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：25℃10min(UNG處理)，95℃預(yù)變性2min；98℃變性10S，55℃退火30S，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；5)結(jié)果判定：電泳紫外燈下觀察，陽性對照有一條530bp的清晰條帶，陰性對照無條帶；若待檢樣品電泳紫外燈下觀察出現(xiàn)大小約為530bp的條帶，即為陽性，表明該樣品含有該病毒；若待檢樣品紫外燈下觀察無條帶，則為陰性，表明該樣品不含該病毒。實(shí)施例3Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒的初步應(yīng)用1、敏感性試驗(yàn)將Ⅰ群禽腺病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株在CEK細(xì)胞上傳代增殖,凍融3次，然后離心取上清提取DNA(濃度為25ng/μL),將提取的DNA進(jìn)行系列稀釋(1:10、1:102、1:103、1:104、1:105、1:106、1:107)，并將系列稀釋的DNA作為模板，用本發(fā)明實(shí)施例1配制的Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒，按照實(shí)施例2中所述方法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示：將提取的Ⅰ群禽腺病毒DNA稀釋到1:105時(shí)，結(jié)果仍然為陽性(見圖1和表1)，試驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)施例1配制的Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒敏感性較好。表1編號1234567稀釋度1:101:1021:1031:1041:1051:1061:107PCR檢測結(jié)果陽性陽性陽性陽性陽性陰性陰性2、特異性試驗(yàn)用本發(fā)明實(shí)施例1配制的Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒，按照實(shí)施例2中所述方法對標(biāo)準(zhǔn)毒株禽腺病毒4型(FAdV-4，Ⅰ群禽腺病毒)和10型(FAdV-10，Ⅰ群禽腺病毒)、5株臨床分離禽腺病毒4型(FAdV-4臨1-3、5-6)、產(chǎn)蛋下降綜合征(EDS，Ⅲ群禽腺病毒)、新城疫、禽流感、大腸桿菌等進(jìn)行檢測，試驗(yàn)結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)毒株Ⅰ群禽腺病毒4型和10型以及5株臨床分離禽腺病毒4型檢測結(jié)果均為陽性，產(chǎn)蛋下降綜合征、新城疫、禽流感、大腸桿菌等檢測結(jié)果均為陰性(見表2)，試驗(yàn)結(jié)果表明特異性較好。表23、臨床樣品檢測：對30份不同地區(qū)采集的雞和鵝心臟、肝臟等疑似病料，用本發(fā)明的檢測試劑盒進(jìn)行檢測，共檢出陽性樣品26份。將陽性樣品PCR產(chǎn)物送上海生物工程公司進(jìn)行測序，與GenBank中登陸的hexon基因序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果均為Ⅰ群禽腺病毒。以上試驗(yàn)結(jié)果充分表明該試劑盒在臨床樣品的檢測中具有很好的特異性。4、重復(fù)性試驗(yàn)：(1)批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次3個(gè)試劑盒對已感染的6份陽性樣品和2份陰性樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示已感染的6份陽性樣品全部擴(kuò)增出目的條帶，而2份陰性樣品均未擴(kuò)增出目的條帶，表明本試劑盒具有較好的批內(nèi)重復(fù)性(見表3)。(2)批間重復(fù)性試驗(yàn)：取不同批次的3個(gè)試劑盒對6份陽性樣品和2份陰性樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示已感染的6份陽性樣品全部擴(kuò)增出目的條帶，而2份陰性樣品均未擴(kuò)增出目的條帶，表明本試劑盒具有較好的批間重復(fù)性(見表4)。表3批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表4批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果序列表<110>湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所<120>一種特異檢測Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒及其檢測方法<160>2<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>上游引物<400>1ATGGCCAAYTTCATGCCCATGG22<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>下游引物<400>2GTGGAAGTACTGWCKGTCGGGCCAG25當(dāng)前第1頁1 2 3