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      一種特異檢測Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒及其檢測方法與流程

      文檔序號:12250076閱讀:來源:國知局

      技術(shù)特征:

      1.一種特異檢測Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒,其特征在于,所述檢測試劑盒包括:

      Ⅰ群禽腺病毒PCR反應液、10×PCR buffer for UNG plus、熱啟動型DNA聚合酶、dU plus dNTP mix、尿嘧啶DNA糖基化酶、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品;其中,所述Ⅰ群禽腺病毒PCR反應液包括:

      (1)濃度為5μM的上游引物,其序列為5‘-ATGGCCAAYTTCATGCCCATGG-3’,

      (2)濃度為5μM的下游引物,其序列為5‘-GTGGAAGTACTGWCKGTCGGGCCAG-3’。

      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異檢測Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒,其特征在于,所述陽性質(zhì)控品為含有目的基因片段的質(zhì)粒,其由下述方法提取得到:

      將Ⅰ群禽腺病毒標準毒株在CEK細胞上傳代增殖,-40℃/常溫條件下凍融2次,然后6000r/min,離心10min,取上清提取DNA。

      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異檢測Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒,其特征在于,所述陰性質(zhì)控品為從健康且無病原的雞只組織提取的DNA,具體提取方法如下:

      采集健康且無病原的雞只組織,按質(zhì)量體積比1g:10mL加入含1%雙抗的PBS,充分勻漿破碎,-40℃/常溫條件下凍融2次,然后6000r/min,離心10min,去除沉淀,取上清提取DNA所得。

      4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的特異檢測Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒,其特征在于,所述檢測試劑盒中各種試劑的含量為:

      。

      5.權(quán)利要求4所述的特異檢測Ⅰ群禽腺病毒PCR檢測試劑盒的檢測方法,其特征在于,步驟具體為:

      1)配制PCR反應體系:分別配制待檢樣品DNA模板、陽性對照、陰性對照的PCR反應體系,具體如下:

      取待檢樣品DNA模板、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各1.0μL,各加入所述10×PCR buffer for UNG plus 5μL、熱啟動型DNA聚合酶0.25μL、dU plus dNTP mix 4μL、Ⅰ群禽腺病毒PCR反應液2μL和尿嘧啶DNA糖基化酶0.5μL,再各用滅菌ddH2O補足至50μL,分別得待檢樣品DNA模板的PCR反應體系、陽性對照的PCR反應體系和陰性對照的PCR反應體系;

      2)進行PCR擴增反應;

      3)結(jié)果判定。

      6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法,其特征在于,步驟1)中所述待檢樣品DNA模板由下述方法提取得到:

      取待檢組織樣品0.1g,加入含1%雙抗的PBS 1mL,勻漿15min,-40℃/常溫條件下反復凍融兩次,6000r/min,離心10min,取上清,提取DNA,得待檢樣品DNA模板。

      7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法,其特征在于,步驟2)中所述PCR擴增反應的進行條件為:

      25℃UNG處理10min,95℃預變性2min;98℃變性10s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30個循環(huán);72℃延伸10min。

      8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法,其特征在于,步驟3)中所述結(jié)果判定方法如下:

      電泳紫外燈下觀察,陽性對照有一條530bp的清晰條帶,陰性對照無條帶;若待檢樣品電泳紫外燈下觀察出現(xiàn)大小約為530bp的條帶,即為陽性,表明該樣品含有該病毒;若待檢樣品紫外燈下觀察無條帶,則為陰性,表明該樣品不含該病毒。

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