一種快速檢測(cè)微生物耐藥性的方法及專用微流控芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)微生物耐藥性的方法及專用微流控芯片，屬于微生物耐 藥性檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物在抗生素等外部環(huán)境壓力下的響應(yīng)特征，對(duì)生態(tài)安全性評(píng)估等十分重要， 一直受到人們的關(guān)注。在響應(yīng)特性中，最受關(guān)注的是微生物的耐藥性，因此人們開(kāi)發(fā)和應(yīng)用 了各種快速檢測(cè)的方法，用于測(cè)定半抑制濃度（ic5(l)或者最小抑制濃度（MIC)。
[0003] 傳統(tǒng)方法采用搖瓶或者平板培養(yǎng)的方式，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的抗生素，通 過(guò)觀察光密度值或菌落計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)估抑制特性。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單，缺點(diǎn) 是耗時(shí)較長(zhǎng)，一般培養(yǎng)需要過(guò)夜，樣品或試劑消耗量較大。此外，還可以采用多孔板方法進(jìn) 行細(xì)菌培養(yǎng)，達(dá)到并行篩選，快速檢測(cè)OD的目的。該方法優(yōu)點(diǎn)是可以節(jié)約藥劑、縮短實(shí)驗(yàn)時(shí) 間、并行獲取數(shù)據(jù)等，缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴、對(duì)于生長(zhǎng)緩慢和OD值較低的細(xì)菌難以觀察，限 制了廣泛應(yīng)用。目前被廣泛應(yīng)用的是E-test抑菌試紙條，通過(guò)在試紙條上固定濃度梯度的 抗生素，結(jié)合平板培養(yǎng)方法，通過(guò)抑菌圈與紙條交點(diǎn)直接讀出MIC值。優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便快速，工 作量小，不足之處是試紙比較昂貴、培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)、只能測(cè)定MIC值、不適合研宄抗生素的 混合作用等。
[0004] 由于上述原因和不足，人們開(kāi)始采用微流控芯片來(lái)進(jìn)行細(xì)菌的抗生素敏感性測(cè) 試。通過(guò)在芯片內(nèi)建立被測(cè)物質(zhì)的濃度梯度，可以避免人為配制的不準(zhǔn)確和費(fèi)時(shí)費(fèi)力。 建立梯度的方法之一是在微流控芯片的通道中或芯片下方加入多孔介質(zhì)，如瓊脂糖層 等，通過(guò)高低濃度之間的擴(kuò)散形成梯度。瓊脂糖是一種凝膠性物質(zhì)且對(duì)微生物沒(méi)有毒害 作用，且具有大孔擴(kuò)散的性能，因此比較合適微生物的固定和培養(yǎng)。比如Cheng等（Lab Chip，2007, 7(6) : 763-769)在芯片的瓊脂糖層中設(shè)置三個(gè)通道，兩邊通道分別持續(xù)通入高 濃度溶液和空白液體，中間通道放入細(xì)菌。高濃度物質(zhì)通過(guò)瓊脂糖層向空白方向擴(kuò)散，從而 在中間通道形成穩(wěn)定的濃度梯度；Si等（LabChip, 2012, 12(7) : 1389-1394)在芯片通道中 間滴入液態(tài)瓊脂糖，待凝固后可將通道兩側(cè)分離，在一側(cè)滴入目標(biāo)物質(zhì)后可通過(guò)瓊脂糖結(jié) 構(gòu)慢慢擴(kuò)散，從而在另一側(cè)形成濃度梯度。Ahmed等（NanoLett，2010, 10 (9): 3379-3385) 設(shè)計(jì)了三種不同結(jié)構(gòu)的微流控芯片，都是通過(guò)瓊脂糖層的擴(kuò)散在測(cè)試通道可形成線性及非 線性的濃度梯度。
[0005] 上述方法可以在數(shù)個(gè)小時(shí)之內(nèi)快速獲得抑制特征，得到MIC值，從而克服傳統(tǒng)方 法的不足。但上述方法也存在不足之處，主要包括：（1)微生物一般都標(biāo)記熒光便于檢測(cè)， 但在實(shí)際測(cè)試中細(xì)菌一般都難以標(biāo)記熒光；（2)在芯片上完成測(cè)試需要精密控制的注射 泵，而在普通實(shí)驗(yàn)室或移動(dòng)野外操作中難以滿足要求；（3) -般只能得到MIC值，而難以獲 得IC5Q值或者整條抑制曲線。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測(cè)微生物耐藥性的方法及專用微流控芯片，該微 流控芯片可實(shí)現(xiàn)微生物的原位培養(yǎng)、梯度暴露和實(shí)時(shí)觀察，不需要注射泵，芯片的關(guān)鍵部件 可以重復(fù)使用；微生物不需要有熒光，普通微生物即可。利用該微流控芯片，能夠?qū)崟r(shí)觀察 到微生物在不同藥物濃度下的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而快速獲得藥物對(duì)微生物的抑制特征。
[0007] 本發(fā)明提供的微流控芯片，它由依次疊加的聚二甲基硅氧烷層（PDMS層）、瓊脂糖 層和透明板組成；
[0008] 所述聚二甲基硅氧烷層設(shè)有兩個(gè)通孔；
[0009] 所述瓊脂糖層由瓊脂糖和分散于其中的微生物組成，由所述透明板支撐。
[0010] 上述微流控芯片中，兩個(gè)所述通孔分別用于儲(chǔ)存藥物和所述微生物的培養(yǎng)基，所 述通孔的孔徑為5?8mm，兩個(gè)所述通孔的中心距離為6?10mm，以保證在兩個(gè)所述通孔之 間形成合適范圍的濃度梯度和便于顯微鏡定位觀察。
[0011] 上述微流控芯片中，所述聚二甲基硅氧烷層的厚度為5?8mm;所述瓊脂糖層的厚 度為0. 03?0. 05mm，微生物接近單層生長(zhǎng)。
[0012] 上述微流控芯片中，所述微生物為細(xì)菌。
[0013] 上述微流控芯片中，所述透明板可為玻璃板、石英玻璃板或者透明塑料板，具體可 為蓋玻片，便于觀察。
[0014] 上述微流控芯片在使用時(shí)，在所述PDMS層上方還可設(shè)有一所述透明板，具體操作 為在兩個(gè)所述通孔中分別加入所述微生物的培養(yǎng)基和藥物，然后在所述PDMS層上方覆蓋 所述透明板，以避免空氣中微生物進(jìn)入所述通孔內(nèi)及液體（培養(yǎng)基）的蒸發(fā)；
[0015] 所述透明板可為玻璃板、石英玻璃板或者透明塑料板，具體可為蓋玻片。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述微流控芯片的制備方法，包括如下步驟：
[0017] (1)在所述聚二甲基硅氧烷層上打孔得到所述通孔；
[0018] (2)將所述微生物分散于所述瓊脂糖中，制得瓊脂糖和微生物的混合液；
[0019] (3)將所述瓊脂糖和微生物的混合液滴加到所述透明板上，用步驟⑴得到的聚 二甲基硅氧烷層按壓后粘合，經(jīng)凝固即可得到所述微流控芯片。
[0020] 上述制備方法，步驟（2)中，所述微生物以微生物懸濁液的形式添加，所述微生物 處于對(duì)數(shù)期；
[0021] 所述瓊脂糖以瓊脂糖水溶液的形式添加，所述瓊脂糖水溶液形成的薄層溶液在室 溫下保持20min后即凝固為多孔膠體，可用于固定微生物；所述瓊脂糖為低熔點(diǎn)瓊脂糖，其 熔點(diǎn)可為60?70°C;所述瓊脂糖水溶液在使用前滅菌；
[0022] 所述微生物懸濁液與所述瓊脂糖水溶液的體積比可為1 :1?2,具體可為1 :1 ;
[0023] 所述微生物懸濁液的0D6(J直可為0. 2?0. 4,具體可為0. 2 ;所述瓊脂糖水溶液中 瓊脂糖的質(zhì)量百分含量可為2?4%，具體可為3%。
[0024] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種利用上述微流控芯片快速檢測(cè)微生物耐藥性的方法，包 括如下步驟：
[0025] (1)在兩個(gè)所述通孔中，分別加入藥物和所述微生物的培養(yǎng)基；
[0026] (2)在步驟⑴后的0?6小時(shí)內(nèi)，拍攝所述觀察區(qū)域內(nèi)不同位置處所述微生物的 照片，得所述觀察區(qū)域內(nèi)不同位置處所述微生物隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)情況；
[0027] 取2?6小時(shí)中某一時(shí)刻所述觀察區(qū)域內(nèi)不同位置處所述微生物的照片，具體可 在步驟（1)后的4小時(shí)這一時(shí)刻觀察所述微生物的形態(tài)，采用圖像軟件計(jì)算所述觀察區(qū)域 內(nèi)不同位置處所述微生物的群落大小，根據(jù)所述藥物的濃度和所述微生物的群落大小即可 對(duì)所述微生物的耐藥性進(jìn)行檢測(cè)；
[0028] 所述觀察區(qū)域?yàn)閮蓚€(gè)所述通孔的邊緣之間的最短連線處所述藥物在所述瓊脂糖 層內(nèi)擴(kuò)散形成的區(qū)域。
[0029] 上述方法中，所述藥物以溶液的形式進(jìn)行添加，所述藥物的溶液為將所述藥物溶 于所述微生物的培養(yǎng)基中得到。
[0030] 上述快速檢測(cè)微生物耐藥性的方法還包括采用熒光素模擬所述藥物，即根據(jù)所述 觀察區(qū)域內(nèi)不同位置處所述熒光素的濃度，得所述觀察區(qū)域內(nèi)不同位置處所述藥物的濃度 的步驟：
[0031] (1)在兩個(gè)所述通孔中，加入相同濃度的熒光素的水溶液，加入20?30min后，具 體可在30min后，用熒光顯微鏡拍攝所述觀察區(qū)域內(nèi)的照片，利用圖像軟件計(jì)算得到該濃 度下的熒光強(qiáng)度，取出該濃度的熒光素的水溶液，加入更高濃度的熒光素的水溶液，得不同 濃度的熒光素水溶液的熒光強(qiáng)度，以所述熒光素的濃度為橫坐標(biāo)，以熒光素的熒光強(qiáng)度為 縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0032] 所述熒光素水溶液的濃度為OmM?20mM;
[0033] (2)在兩個(gè)所述通孔中，分別加熒光素的水溶液和水，擴(kuò)散0?6h時(shí)，