暴露于阿莫西林4小時這一時刻時的細菌群落照片，得到如圖6所示的結果。 根據(jù)大腸桿菌群落大小和形態(tài)，判斷完全抑制和不抑制的群落，如圖6中在濃度為0. 5mg/ L時大腸桿菌在正常生長并形成菌落，完全不抑制；而在濃度為3mg/L時大腸桿菌形態(tài)發(fā)生 變化并且未發(fā)生分裂增殖，說明被完全抑制。通過此步驟可以粗略估計大腸桿菌對阿莫西 林的耐藥程度，從圖6中可知在3mg/L時該大腸桿菌就被抑制，說明是敏感菌而不是耐藥 菌。
[0075] (3)按照實施例1中的步驟，重新制備微流控芯片，使用熒光素模擬藥物，操作如 下：
[0076]A、配制濃度分別為0mM、lmM、5mM和20mM的熒光素溶液，在兩個通孔中由低到高分 別加入0. 05mL不同濃度的熒光素，每種濃度的熒光素溶液加入30min后用熒光顯微鏡拍攝 兩孔之間的瓊脂層熒光圖片，拍攝完成后將該濃度的熒光素溶液取出再滴加更高濃度的熒 光素溶液，即首先在兩個通孔中均加入OmM的熒光素溶液（空白），30min后拍攝兩孔之間 的瓊脂層熒光圖片，然后取出熒光素溶液再次滴加ImM的熒光素溶液，30min后拍攝兩孔之 間的瓊脂層熒光圖片，依次類推直至滴加20mM的熒光素溶液，30min后拍攝兩孔之間的瓊 脂層熒光圖片。通過ImageJ軟件對圖片進行分析得到該濃度下的熒光素強度，從而獲得不 同焚光素濃度下的焚光強度。以焚光素的濃度為橫坐標，以焚光素的焚光強度為縱坐標，建 立標準曲線，如圖3所示，在熒光素濃素為OmM?20mM的范圍內，熒光強度與熒光素濃度成 正比。
[0077]B、在兩個通孔中分別加入0.05mL10mM異硫氰酸熒光素（F4274,sigma，分子量為 332. 31)的水溶液和0. 05mL的純水，用熒光顯微鏡記錄擴散0-6h內兩個通孔邊緣之間最短 連線的不同位置處熒光素的熒光強度，以不同位置處與1#孔之間的距離為橫坐標，熒光強 度為縱坐標，建立兩者之間的關系曲線，得熒光素在兩個通孔邊緣之間的最短連線內的分 布圖，如圖4所示，分別為擴散10min、20min和360min后熒光素在兩個通孔邊緣之間的最 短連線的分布圖。由圖4可知，當間距為1mm時，擴散20min濃度梯度即達到穩(wěn)定。
[0078]C、由于熒光強度與熒光素的濃度成正比，并且在20min時濃度梯度達到穩(wěn)定，因 此選擇擴散lh時兩個通孔邊緣之間的最短連線的不同位置處熒光素的熒光強度分布，得 兩個通孔邊緣之間的最短連線處不同位置處阿莫西林的濃度，如圖5所示。
[0079] (4)利用圖像軟件ImageJ對菌落的面積進行計算，菌落面積可代表生物量。通 過菌落面積計算大腸桿菌在不同阿莫西林濃度條件下的比生長速率U，計算方法見公式 1-1，通過比生長速率得到抑制率IR，其計算方法見公式1-2 :
[0080]
【主權項】
1. 一種微流控芯片，它由依次疊加的聚二甲基硅氧烷層、瓊脂糖層和透明板組成； 所述聚二甲基硅氧烷層設有兩個通孔； 所述瓊脂糖層由瓊脂糖和分散于其中的微生物組成，由所述透明板支撐。
2. 根據(jù)權利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述通孔的孔徑為5?8mm，兩個 所述通孔的中心距離為6?10mm。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于：所述聚二甲基硅氧烷層的厚 度為5?8mm ; 所述瓊脂糖層的厚度為〇. 03?0. 05mm。
4. 根據(jù)權利要求1-3中任一項所述的微流控芯片，其特征在于：所述微生物為細菌。
5. 根據(jù)權利要求1-4中任一項所述的微流控芯片，其特征在于：所述透明板為玻璃板、 石英玻璃板或者透明塑料板。
6. 權利要求1-5中任一項所述微流控芯片的制備方法，包括如下步驟： (1) 在聚二甲基硅氧烷層上打孔得到所述通孔； (2) 將微生物分散于瓊脂糖中，制得瓊脂糖和微生物的混合液； (3) 將所述瓊脂糖和微生物的混合液滴加到所述透明板上，用步驟（1)得到的聚二甲 基硅氧烷層按壓后粘合，經凝固即可得到所述微流控芯片。
7. 根據(jù)權利要求6所述的制備方法，其特征在于：步驟（2)中，所述微生物以微生物懸 濁液的形式添加，所述微生物處于對數(shù)期； 所述瓊脂糖以瓊脂糖水溶液的形式添加； 所述微生物懸濁液與所述瓊脂糖水溶液的體積比為1 :1?2 ; 所述微生物懸濁液中所述微生物的〇D_值為0. 2?0. 4 ; 所述瓊脂糖水溶液中瓊脂糖的質量百分含量為2?4%。
8. 利用權利要求1-7中任一項所述的微流控芯片快速檢測微生物耐藥性的方法，包括 如下步驟： (1) 在兩個所述通孔中，分別加入藥物和所述微生物的培養(yǎng)基； (2) 在步驟（1)后的0?6小時內，拍攝所述觀察區(qū)域內不同位置處所述微生物的照 片，得所述觀察區(qū)域內不同位置處所述微生物隨時間變化的生長情況； 取2?6小時中某一時刻所述觀察區(qū)域內不同位置處所述微生物的照片，觀察所述微 生物的形態(tài)，采用圖像軟件計算所述觀察區(qū)域內不同位置處所述微生物的群落大小，根據(jù) 所述藥物的濃度和所述微生物的群落大小即可對所述微生物的耐藥性進行檢測； 所述觀察區(qū)域為兩個所述通孔的邊緣之間的最短連線處所述藥物在所述瓊脂糖層內 擴散形成的區(qū)域。
9. 根據(jù)權利要求8所述的快速檢測微生物耐藥性的方法，其特征在于：所述藥物以溶 液的形式進行添加，所述藥物的溶液為將所述藥物溶于所述微生物的培養(yǎng)基中得到。
10. 根據(jù)權利要求8或9所述的快速檢測微生物耐藥性的方法，其特征在于：所述方法 還包括采用熒光素模擬所述藥物，即根據(jù)所述觀察區(qū)域內不同位置處所述熒光素的濃度， 得所述觀察區(qū)域內不同位置處所述藥物的濃度的步驟： (1)在兩個所述通孔中，加入相同濃度的熒光素的水溶液，加入20?30min后用熒光顯 微鏡拍攝所述觀察區(qū)域內的照片，利用圖像軟件計算得到該濃度下的熒光強度，取出該濃 度的熒光素的水溶液，加入更高濃度的熒光素的水溶液，得不同濃度的熒光素水溶液的熒 光強度，以所述焚光素的濃度為橫坐標，以焚光素的焚光強度為縱坐標，建立標準曲線； 所述熒光素水溶液的濃度為OmM?20mM ; (2) 在兩個所述通孔中，分別加熒光素的水溶液和水，擴散0?6h時，用熒光顯微鏡拍 攝所述觀察區(qū)域內的照片，利用圖像軟件計算所述觀察區(qū)域內不同位置處熒光素的熒光強 度； 所述熒光素的水溶液中，所述熒光素的濃度為10mM?20mM ; 所述觀察區(qū)域為兩個所述通孔的邊緣之間的最短連線處所述熒光素在所述瓊脂糖層 內擴散形成的區(qū)域； (3) 根據(jù)所述標準曲線和擴散0?6h內不同時刻所述觀察區(qū)域內不同位置處所述熒光 素的熒光強度，即可得到擴散0?6h內不同時刻所述觀察區(qū)域內不同位置處所述要藥物的 濃度； 所述熒光素的分子量與所述藥物的分子量之間的偏差小于±30%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測微生物耐藥性的方法及專用微流控芯片。該微流控芯片，它由依次疊加的聚二甲基硅氧烷層、瓊脂糖層和透明板組成；所述聚二甲基硅氧烷層設有兩個通孔；所述瓊脂糖層由瓊脂糖和微生物組成，由所述透明板支撐。本發(fā)明微流控芯片可實現(xiàn)微生物的原位培養(yǎng)、梯度暴露和實時觀察；結構簡單、操作簡單，可以快速制備和檢驗，便于普通生物實驗室采用；不需要注射泵；微生物不需要有熒光，普通微生物即可；芯片的關鍵部件可以重復使用，成本低廉，適合日常操作。本發(fā)明方法能夠實時觀察到微生物在不同藥物濃度下的生長狀態(tài)，從而快速獲得藥物對微生物的抑制特征；不僅可得最小抑制濃度MIC值，還可得半數(shù)抑制濃度IC50值和整條抑制曲線。
【IPC分類】C12M1-34, C12Q1-18
【公開號】CN104593253
【申請?zhí)枴緾N201510026001
【發(fā)明人】李冰, 邱勇, 聶智華, 施漢昌
【申請人】清華大學
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月19日