用熒光顯微 鏡拍攝所述觀察區(qū)域內(nèi)的照片，利用圖像軟件計算所述觀察區(qū)域內(nèi)不同位置處熒光素的熒 光強度；
[0034] 所述熒光素的水溶液中，所述熒光素的濃度可為10mM?20mM，具體可為10mM;
[0035] 所述觀察區(qū)域為兩個所述通孔的邊緣之間的最短連線處所述熒光素在所述瓊脂 糖層內(nèi)擴散形成的區(qū)域；
[0036] (3)根據(jù)所述標準曲線和擴散0?6h內(nèi)不同時刻所述觀察區(qū)域內(nèi)不同位置處所述 熒光素的熒光強度，即可得到擴散〇?6h內(nèi)不同時刻所述觀察區(qū)域內(nèi)不同位置處所述要藥 物的濃度，根據(jù)觀察可在擴散平衡后的某一時刻，具體可根據(jù)擴散lh這一時刻所述觀察區(qū) 域內(nèi)不同位置處所述熒光素的熒光強度，得擴散lh這一時刻所述觀察區(qū)域內(nèi)不同位置處 所述藥物的濃度；
[0037] 所述熒光素的分子量與所述藥物的分子量之間的偏差小于±30%，偏差的計算公 式如下：（藥物的分子量-焚光素的分子量）/焚光素的分子量X100%。
[0038] 上述方法中，常用的圖像軟件為ImageJ。
[0039] 上述方法中，在所述加入之前還包括除去所述通孔中所述瓊脂糖和所述微生物的 步驟。
[0040] 上述方法中，根據(jù)所述藥物的半數(shù)抑制濃度和最小抑制濃度對所述微生物的耐藥 性進行判定。
[0041] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0042] 1)本發(fā)明微流控芯片可實現(xiàn)微生物的原位培養(yǎng)、梯度暴露和實時觀察。
[0043] 2)本發(fā)明微流控芯片結構簡單、操作簡單，可以快速制備和檢驗，便于普通生物實 驗室采用。
[0044] 3)本發(fā)明微流控芯片不需要注射泵，只需拍攝明場圖片；芯片的關鍵部件可以重 復使用，成本低廉，適合日常操作。
[0045] 4)通過本發(fā)明提供的快速檢測微生物耐藥性的方法，能夠實時觀察到微生物在不 同藥物濃度下的生長狀態(tài)，從而快速獲得藥物對微生物的受抑制特征。
[0046] 5)本發(fā)明提供的快速檢測微生物耐藥性的方法，不僅可以得到最小抑制濃度MIC 值，還可以獲得半數(shù)抑制濃度IC5(I值和整條抑制曲線。
【附圖說明】
[0047] 圖1為本發(fā)明微流控芯片的結構示意圖。
[0048] 圖2為本發(fā)明微流控芯片的剖面示意圖。
[0049] 圖3為熒光素強度與熒光素濃度的線性關系圖。
[0050] 圖4為在擴散0?6h內(nèi)觀察區(qū)域內(nèi)的熒光素強度分布變化圖。
[0051] 圖5為擴散穩(wěn)定后（lh)觀察區(qū)域內(nèi)阿莫西林濃度分布圖。
[0052] 圖6為顯微鏡拍攝的觀察區(qū)域內(nèi)不同位置處的大腸桿菌在阿莫西林作用4h時的 生長狀態(tài)。
[0053]圖7為大腸桿菌在阿莫西林作用下的抑制曲線。
[0054] 圖1和圖2中各標記如下：
[0055] 1PDMS層、2瓊脂糖層、3蓋玻片、4通孔（1#和2#)、5觀察區(qū)域。
【具體實施方式】
[0056] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0057] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0058] 實施例1、微流控芯片及其制備
[0059] 如圖1和圖2所示，本發(fā)明提供的微流控芯片為三層結構，從上到下依次為長度和 寬度均為24臟、厚度為8mm的聚二甲基硅氧烷層（PDMS層）1，厚度為0? 03?0? 05mm的瓊 脂糖層2和蓋玻片3 (24mmX24mm)，PDMS層中設有兩個孔徑為5mm的通孔4 (如圖所示，左 側記為1#通孔，右側記為2#通孔），1#通孔和2#通孔中心之間的距離為6mm，即兩個通孔 邊緣之間的最短距離為1mm，形成觀察區(qū)域5,瓊脂糖層由瓊脂糖水溶液（3wt% )和稀釋后 的大腸桿菌懸濁液（〇D_值約為0. 2,對數(shù)期）以體積比為1 :1的比例混合而成。
[0060] 本發(fā)明微流控芯片具體通過下述步驟制備得到：
[0061] (1)加工和制備PDMS層
[0062] 首先采用表面平整的硅板用翻模法制備出PDMS芯片：清洗模板后進行脫模劑沉 積，然后倒入8mm厚的娃橡膠，抽氣、加熱、切膠，獲得24mmX24mm的正方體PDMS結構，由于 PDMS結構與硅片接觸的面比較平整，稱為光滑面或工作面，倒模時暴露在空氣一側的面稱 為非光滑面。將PDMS結構平放，光滑面朝上，使用5mm打孔器，沿PDMS光滑面中部開雙孔， 穿透整個PDMS結構，孔徑為5mm，孔之間的邊緣間距（最短距離）為1mm，兩個孔分別作為 藥物貯液池和培養(yǎng)基貯液池。
[0063] (2)制備瓊脂糖層
[0064]按照標準方法配制大腸桿菌液體培養(yǎng)基，接種和培養(yǎng)大腸桿菌（ATCC25922)，在 搖床中培養(yǎng)，保持溫度37°C，震蕩速度120rpm。培養(yǎng)3-4h取對數(shù)期大腸桿菌，采用PBS將 大腸桿菌離心清洗三遍后，再將菌懸浮至新鮮培養(yǎng)基中并稀釋至〇D_值約為0. 2。瓊脂糖 采用低熔點瓊脂糖（A9045,Sigma)，用超純水配制，濃度為3wt%，經(jīng)高壓蒸汽滅菌鍋121°C 滅菌20分鐘后在4°C保存?zhèn)溆?。將凝固態(tài)的瓊脂糖溶液在水浴鍋70°C完全溶解后，再調(diào)整 水浴鍋溫度降低到45°C，使瓊脂糖溶液的溫度保持在45°C。然后在超凈臺中分別取0. 5mL 瓊脂糖溶液及〇. 5mL大腸桿菌懸濁液以1 :1 (v/v)的比例至lmL離心管中混合，并用渦流式 振蕩器將混合液搖勻放入45 °C水浴鍋中待用。
[0065] 取24mmX24mm規(guī)格的蓋玻片，用丙酮、甲醇、異丙醇、酒精依次超聲清洗表面3分 鐘后用氮氣吹干，然后放置于超凈臺紫外滅菌30分鐘后待用。使用移液器取0.lmL上述制 備得到的瓊脂糖-細菌混合液，滴在玻片中央后，然后將PDMS芯片輕輕從一側蓋在瓊脂糖 上（PDMS的光滑面朝下），防止氣泡產(chǎn)生并輕輕往下壓PDMS芯片，使瓊脂糖層盡可能較薄， 厚度在0. 03?0. 05mm之間。多余瓊脂糖會進入芯片的孔中，待瓊脂糖完全凝固后，用鑷子 再輕輕將PDMS芯片通孔內(nèi)的凝固瓊脂糖去除，瓊脂糖層制備完成。
[0066] (3)組合芯片
[0067] 瓊脂糖凝固后PDMS便通過瓊脂糖層與蓋玻片粘合在一起，即得本發(fā)明微流控芯 片。該微流控芯片在使用時，在兩個通孔孔內(nèi)分別滴加50yL培養(yǎng)基及藥物，然后再將清洗 好的蓋玻片蓋在PDMS層上方，避免空氣中微生物進入孔內(nèi)及液體蒸發(fā)。實驗結束后，可將 三層芯片拆開清洗。PDMS層、蓋玻片等經(jīng)過清洗和滅菌后可以重復利用。
[0068] 實施例2、快速檢測大腸桿菌耐藥性
[0069] 按照標準方法配制10mg/L的阿莫西林（分子量：419. 5)溶液，與2倍標準濃度 (指配置培養(yǎng)基時，成分濃度是給定標準的2倍，使其1 :1稀釋后與標準培養(yǎng)基的成分濃度 相同）的培養(yǎng)基等體積混合，得到含有實際濃度為5mg/L阿莫西林的培養(yǎng)基。
[0070] 按照實施例1中的步驟制備得微流控芯片，開始耐藥性實驗，步驟如下：
[0071] (1)首先在微流控芯片的1#通孔和2#通孔內(nèi)滴加0.05mL的LB培養(yǎng)基（具體體 積可根據(jù)孔直徑調(diào)節(jié)），使培養(yǎng)基與瓊脂糖層內(nèi)的微生物接觸。在20分鐘后，將1#通孔內(nèi) 的培養(yǎng)基吸出，添加〇. 〇5mL含有5mg/L阿莫西林的培養(yǎng)基，作為抗生素擴散的源。2#通孔 不含有抗生素，作為抗生素擴散梯度的匯。
[0072] (2)將芯片放置在倒置光學顯微鏡上的操作臺上，使用夾子壓在PDMS非光滑面固 定芯片，40X物鏡觀察。
[0073] 在步驟⑴之后的0-6小時內(nèi)，用顯微鏡觀察和拍攝觀察區(qū)域不同位置的單個細 菌隨時間變化的生長情況。正常生長的細菌會逐漸形成菌斑或團簇。阿莫西林可在兩個孔 之間形成濃度梯度，并且該濃度梯度可以保持至少6小時。
[0074] 記錄