_02866543 梭菌屬，SEQ ID N0:27;XP_367221 稻瘟菌屬（Magnaporthe)， SEQ ID N0:44;ZP_07042437 擬桿菌屬，SEQ ID N0:45;ZP_05759807 擬桿菌屬，SEQ ID N0:46;ZP_05287524 擬桿菌屬，SEQ ID N0:47;ZP_06076108 擬桿菌屬，SEQ ID N0:48; YP_001302992Parabacteroides, SEQ ID N0:49〇
[0142] 圖33含有圍繞CcManSpm的活性位點(diǎn)的殘基的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
[0143] 圖34含有PDB入口 2xsg中的兩個(gè)CcManSpm分子的不對稱單元中的蛋白Ca原 子和催化性Ca2+原子，描述了蛋白質(zhì)的整體折疊。
[0144] 詳細(xì)說明
[0145] -般而言，本文件提供了水解糖蛋白上的甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接，產(chǎn)生具 有脫帽的磷酸-6-甘露糖（M6P)殘基的靶分子（例如，靶蛋白）的方法和材料。本文描述 的方法和材料特別有效的用于產(chǎn)生治療患有溶酶體貯積癥（LSD)的患者的試劑），LSD是一 大類遺傳性的代謝功能障礙，其特征是由于涉及降解作用的異化酶活性受損，儲藏產(chǎn)物在 溶酶體中累積。儲藏產(chǎn)物的積累導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和進(jìn)行性的臨床表現(xiàn)。可以通過酶替換 療法（ERT)校正異化酶的缺陷，只要所施用的酶可以靶向到疾病細(xì)胞的溶酶體中。溶酶體 酶通常是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)中合成的糖蛋白，通過分泌通路運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中，然后被募集到 溶酶體。溶酶體酶向溶酶體遞送的一種方式是通過陽離子依賴性（CD)的甘露糖6-磷酸受 體（MPR)。M6P末端的聚糖在跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)（TRN)中被2種MPR識別，介導(dǎo)溶酶體酶從分 泌通路分選病將酶遞送至溶酶體。使用本文描述的方法和材料，可以使用基于微生物的生 產(chǎn)方法獲得含脫帽M6P的聚糖的治療性蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)可以利用同一 M6P依賴性通路 遞送至溶酶體中。因而，本文描述的方法和材料可用于制備治療代謝功能障礙的糖蛋白，例 如 LSD。
[0146] 甘露糖苷酶
[0147] 本文件提供了編碼能夠水解寡糖上的末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接的甘露 糖苷酶多肽分離的核酸，以及能夠水解寡糖上的末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接的分 離的甘露糖苷酶。術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"在本文中可互換的使用，指RNA和DNA，包括 cDNA、基因組DNA、合成的DNA和含有核酸類似物的DNA (或RNA)。多核苷酸可以具有任何 的三維結(jié)構(gòu)。核酸可以是雙鏈的或單鏈的（即，正義鏈或反義鏈）。多核苷酸的非限制性 實(shí)例包括基因、基因片段、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、siRNA、微 RNA、核酶、cDNA、重組的多核苷酸、分支的多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任 何序列的分離的RNA、核酸探針和引物，以及核酸類似物。
[0148] "多肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換的使用，意指任何肽鍵連接的氨基酸鏈，不論 長度或翻譯后修飾。通常，當(dāng)本文描述的多肽（例如，甘露糖苷酶或具有脫掉的M6P殘基 的靶蛋白）按重量計(jì)構(gòu)成制品中的總蛋白質(zhì)的至少60%時(shí)，所述多肽是分離的，例如樣品 中60%的總蛋白。在一些實(shí)施方案中，本文描述的多肽由按重量計(jì)制品中至少75%、至少 90%或至少99%的總蛋白構(gòu)成。
[0149] "分離的核酸"指與存在于天然存在的基因組中的其他核酸分子分開的核酸，包括 通常在天然存在的基因組（例如，酵母基因組）中位于核酸一側(cè)或兩側(cè)的側(cè)翼的核酸。術(shù) 語"分離的"在本文中涉及核酸時(shí)，還包括任何非天然存在的核酸序列，因?yàn)榇祟惙翘烊淮?在的序列不可見于自然界，且在天然存在的基因組中沒有直接連續(xù)的序列。
[0150] 分離的核酸可以是例如DNA分子，只要去除或缺少了在緊靠天然存在的基因組中 的DNA分子側(cè)翼通?？梢姷囊环N核酸序列。因而，分離的核酸包括但不限于作為獨(dú)立于其 他序列的分隔的分子存在的DNA分子（例如，化學(xué)合成的核酸，或由PCR或限制性內(nèi)切核酸 酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段），以及整合到載體、自主復(fù)制的質(zhì)粒、病毒（例如，任 何的副粘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒或肝病毒）中或整合到原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的 基因組DNA中的DNA。此外，分離的核酸可以包括改造過的核酸，例如部分是雜合體或融合 核酸的DNA分子。在例如cDNA文庫或基因組文庫中，或者含有基因組DNA限制性消化的凝 膠切片中，與數(shù)百至數(shù)百萬種其他核酸共存的核酸不被認(rèn)為是分離的核酸。
[0151] 術(shù)語"外源性"在本文中涉及核酸和特定的宿主細(xì)胞時(shí)，指在自然界中可發(fā)現(xiàn)的特 定細(xì)胞中不存在（且不能獲得）的任何核酸。因而，非天然存在的的核酸一旦被導(dǎo)入宿主細(xì) 胞中，則被認(rèn)為是對宿主細(xì)胞外源性的。重要的是，應(yīng)注意非天然存在的核酸可以含有自然 界中發(fā)現(xiàn)的核酸序列的核酸子序列或片段，只要所述核酸作為整體不存在于自然界中。例 如，表達(dá)載體中的含有基因組DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，因而一旦導(dǎo)入宿 主細(xì)胞中，對宿主細(xì)胞就是外源性的，因?yàn)樗龊怂岱肿幼鳛檎w（基因組DNA加載體DNA) 不存在于自然界。因而，任何作為整體不存在于自然界中的載體、自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《?(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或肝病毒）都被認(rèn)為是非天然存在的核酸。由此可見，通過PCR 或限制性內(nèi)切核酸酶處理產(chǎn)生的基因組DNA片段以及cDNA被認(rèn)為是非天然存在的核酸，因 為它們作為分隔的分子存在，不可見于自然界。還由此可見，任何含有啟動子序列和多肽編 碼序列（例如，cDNA或基因組DNA)處于自然界中不可見的排列的核酸是非天然存在的核 酸。天然存在的核酸對特定的細(xì)胞而言可以是外源性的。例如，從酵母X的細(xì)胞中分離的 完整染色體對于酵母y的細(xì)胞是外源性的核酸，只要所述染色體被導(dǎo)入酵母細(xì)胞中。
[0152] 編碼甘露糖苷酶的核酸可以與SEQIDN0:6、SEQIDN0:8、SEQIDN0:10、 SEQIDN0:12或SEQIDN0:14所述的核苷酸序列至少70%序列同一性（例如，至少 80% ,85% ,90% ,95% ,97% ,98%，99 %或100 %序列同一性）。在一些實(shí)施方案中， 本文描述的核酸可以編碼與SEQIDN0s:7, 9, 11，13, 15, 50所述的氨基酸序列具有至少 70% (例如，至少75, 80, 85, 90, 95, 99或100%)同一性的甘露糖苷酶多肽。例如，核酸可 以編碼與SEQIDN0:15或SEQIDN0:50所述的氨基酸序列，或其一部分具有至少90% (例如，至少95或98%)同一性的甘露糖苷酶。例如，核酸可以編碼與SEQIDN0:50的 1至774位殘基具有至少90%同一性的甘露糖苷酶。如下確定特定的氨基酸序列和SEQ IDNO:7, SEQIDNO:9, SEQIDNO: 11，SEQIDNO: 13, SEQIDNO: 15 或 SEQIDNO:50 所述 氨基酸序列之間的百分比同一性。首先，使用含有BLASTP 2. 0. 14版的單機(jī)版BLASTZ的 BLAST 2Sequences(B12seq)程序比對氨基酸序列。該單機(jī)版BLASTZ可自Fish&Richardson 的網(wǎng)站（例如，www. fr. com/blast/)或美國政府的國立生物技術(shù)信息中心的網(wǎng)站(www. ncbi. nlm. nih. gov)獲得。角軍釋々口/[可j申用B12sea茅呈序的i兌明可見于BLASTZ所附的readme 文件中。B12sea在兩條氨基酸序列之間使用BLASTP算法實(shí)施比較。為了比較兩條氨基 酸序列，B12seq的選項(xiàng)設(shè)置如下：-i設(shè)為含有待比較的第一氨基酸序列的文件（例如， C:\seql.txt) ;_j設(shè)為含有待比較的第二氨基酸序列的文件（例如，C:\seq2. txt) ;_p設(shè) 為blastp;-0設(shè)為任何理想的文件名（例如，C:\output. txt);所有其他選項(xiàng)都保持原有 的默認(rèn)設(shè)置。例如，可以使用下列命令產(chǎn)生含有兩條氨基酸下列之間的比較的輸出文件： C:\B12seq_i c:\seql.txt_j c:\seq2.txt_p blastp - o c: \output. txt。如果兩條比 較序列具有同源性，則設(shè)計(jì)的輸出文件將展現(xiàn)比對序列的同源性區(qū)域。如果兩條比較序列 沒有同源性，則設(shè)計(jì)的輸出文件將不展現(xiàn)比對的序列。對于除使用blastn以外，對核酸序 列遵循相似的程序。
[0153] -經(jīng)比對，通過計(jì)數(shù)兩條序列中都存在的相同氨基酸殘基的位置數(shù)，來確定匹配 數(shù)。通過將匹配數(shù)除以全長甘露糖苷酶多肽氨基酸序列的長度，再將獲得的值乘以100,確 定百分比同一性。例如，當(dāng)與SEQ ID N0:7所述序列比對時(shí)具有700個(gè)匹配的氨基酸序列 與 SEQ ID N0:7 所述序列 77. 8%相同（即，700 + 900*100 = 77. 8)。
[0154] 應(yīng)注意，百分比同一性值四舍五入至最接近的十分之幾。例如，78. 11、78. 12、 78. 13 和 78. 14 四舍五入至 78. 1，而 78. 15、78. 16、78. 17、78. 18 和 78. 19 四舍五入至 78. 2。 還應(yīng)注意，長度值總是整數(shù)。
[0155] 應(yīng)理解，多個(gè)核酸可以編碼具有特定氨基酸序列的多肽。遺傳密碼的簡并性是本 領(lǐng)域普遍已知的；即，對于許多氨基酸，有一個(gè)以上的核苷酸三聯(lián)體作為所述氨基酸的密 碼子。例如，可以修飾給定的甘露糖苷酶多肽的編碼序列中的密碼子，使得獲得在特定物 種（例如，細(xì)菌或真菌）中的最佳表達(dá)。例如，可以將SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID 勵：10、5￡0 10勵：12或5￡0 10勵：14所述的核酸密碼子優(yōu)化用于￡.(：〇11表達(dá)，如圖14-18 所述（參見 SEQ ID NOs: 16-20)。
[0156] 還可以使用雜交來評估兩條核酸序列之間的同源性。本文中描述的核酸序列或 其片段可用作根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)的雜交探針。目標(biāo)探針（例如，含有一部分CcMan5核苷 酸序列的探針）與來自測試來源的DNA或RNA的雜交是測試來源中存在與探針對應(yīng)的DNA 或RNA(例如，CcMan5核苷酸序列）的指針。雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可見于 Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, N. Y. , 6. 3. 1-6. 3. 6, 1991 中。中等的雜交條件定義為與以下條件等價(jià)的條件，即，30°C下在2X氯化鈉/檸檬酸鈉 (SSC)中雜交，再在50°C下在IX SSC，0. 1% SDS中洗滌。高嚴(yán)謹(jǐn)度的條件定義為與以下條 件等價(jià)的條件，即，45°C下在6X氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)中雜交，再在65°C下在0. 2X SSC， 0? 1% SDS中洗滌。
[0157] 還可以基于本文描述的一部分C. cellulans甘露糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)（SEQ ID NO: 50的1-774位殘基，也稱為CcManSuJ，來鑒別能夠雜交寡糖上的末端甘露糖-1-磷 酸-6-甘露糖連接的甘露糖苷酶多肽?？梢酝ㄟ^例如X射線衍射CcManSpm的晶體，確定三 維結(jié)構(gòu)。CcManSpm的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)（例如，儲藏在Protein Data Bank(世界范圍的網(wǎng)站H3B. org中的TOB ID No. 2xs下）中的CcMar^m的坐標(biāo)），圖33中所述關(guān)于CcMan5的催化中 心的坐標(biāo)，或者圖34中所述關(guān)于PDB入口 2xsg中的兩個(gè)CcManSpm分子的不對稱單元中 的蛋白C a原子和催化性Ca2+原子的坐標(biāo)，可用于多種用途，包括但不限于表征能夠水解 寡糖上的末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接的甘露糖苷酶的三維結(jié)構(gòu)，以及可視化、鑒別 和表征這樣的甘露糖苷酶區(qū)域，所述區(qū)域參與接受甘露糖-6-磷酸a，1_甘露糖（后文中 稱為Man-P-Man)作為底物并賦予所述酶水解Man-P-Man產(chǎn)生末端磷酸-6-甘露糖的能力。 "結(jié)構(gòu)坐標(biāo)"是與分子或分子復(fù)合物中原子相對于其他原子的空間關(guān)系對應(yīng)的笛卡爾坐標(biāo)。 結(jié)構(gòu)坐標(biāo)可使用X射線衍射技術(shù)或NMR技術(shù)獲得，或者可以使用分子取代分析或同源性建 模推斷。各種軟件程序允許圖示結(jié)構(gòu)坐標(biāo)組，獲得分子或分子復(fù)合物的三維展示。可以通 過數(shù)學(xué)操作修飾由圖33或圖34提供的原始組得到本文描述的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，例如通過 倒置或整體加入或減去。由此，應(yīng)認(rèn)識到本發(fā)明的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)是相對的，不以任何方式受圖33 或圖34的實(shí)際x、y、z坐標(biāo)的具體限制。
[0158] 如實(shí)施例8所述，CcManSpm的結(jié)構(gòu)由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N端的@ -夾心結(jié)構(gòu)域（SEQ ID N0:50的8-271位殘基）和C端的（a a)6桶狀結(jié)構(gòu)域（SEQ ID N0:50的291-771位殘 基），通過a-螺旋接頭（SEQ ID N0:50的272-290位殘基）連接。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的界面 產(chǎn)生了攜帶保守的催化性Ca2+離子的空洞形狀，并產(chǎn)生-1底物結(jié)合位點(diǎn)（命名如Davies 等人，Biochem.J. 321:557-9(1997)所述）和催化中心的形狀。SEQ ID N0:50 的 22、25、71、 72、195、196、354、405、535、536、588、589、626、658、660 和 662 位殘基形成底物結(jié)合位點(diǎn)。
[0159] 可以使用H)B ID No. 2xs的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)或圖33所示的摘要（包括CcMar^m的活性 位點(diǎn)周圍的殘基）或圖34所示的摘要（包括PDB入口 2xsg中的兩個(gè)CcManSpm分子的不對 稱單元中的蛋白C a原子和催化性Ca2+原子），部分或全部的表征CcManSpm的三維結(jié)構(gòu)， 并描述蛋白質(zhì)的整體折疊。例如，可以通過根據(jù)H)B ID No. 2xs的7-771位氨基酸殘基的 結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，土不超過2A的所述氨基酸的保守性骨架原子的均方根誤差，來表征CcManSpm 的三維結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，CcManSpm的三維結(jié)構(gòu)包括根據(jù)ID No. 2xs的氨基 酸的全部結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，土不超過2A的所述氨基酸的保守性骨架原子的均方根誤差（例如，不 超過1.5 A、1.0A或0.5A)。在本文中，"均方根誤差"是偏離均值的方差平方的算數(shù)平均 值的均方根，是表示本文所述結(jié)構(gòu)坐標(biāo)的偏差或方差的方式。本公開內(nèi)容包括所有包含所 示氨基酸殘基的保守性取代的實(shí)施方案，所述保守性取代導(dǎo)致落入所述均方根誤差范圍內(nèi) 的相同結(jié)構(gòu)坐標(biāo)。
[0160] 本文提供的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)可用于表征甘露糖苷酶多肽的三維結(jié)構(gòu)。根據(jù)此類結(jié)構(gòu)， 可以將底物結(jié)合位點(diǎn)例如通過計(jì)算機(jī)可視化、鑒別和表征，基于分子的表面結(jié)構(gòu)、表面電 荷、位阻排列、反應(yīng)氨基酸的存在、疏水性或親水性的區(qū)域等。為了使用本文所述結(jié)構(gòu)產(chǎn) 生的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，如圖33、圖34或roB ID No. 2xs所述，可以將相關(guān)的坐標(biāo)展示為或轉(zhuǎn)化 為三維形狀或圖像呈現(xiàn)。能夠從結(jié)構(gòu)坐標(biāo)組產(chǎn)生分子或其部分的三維圖像呈現(xiàn)的軟件程 序是可商購的?？缮藤彽能浖绦?qū)嵗ǖ幌抻谝韵碌模篏RID(0xford University, Oxford,UK) ；MCSS(Molecular Simulations,San Diego,CA) ；AUT0D0CK(Scripps Research Institute, La Jolla, CA) ；D0CK(University of California, San Francisco, CA)； Flo99 (Thistlesoft, Morris Township, NJ) ；Ludi(Molecular Simulations, San Diego, CA) ；QUANTA(Molecular Simulations,San Diego,CA) ；Insight(Molecular Simulations, San Diego, CA) ;SYBYL(TRIP0S，Inc.，St.Louis.MO);和 LEAPFR0G(TRIP0S，Inc.， St. Louis, MO) 〇
[0161] 本文描述的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)可以用于標(biāo)準(zhǔn)的同源性建模技術(shù)，從而確定分子或分子復(fù)合 物的未知三維結(jié)構(gòu)。同源性建模涉及使用一個(gè)或多個(gè)相關(guān)蛋白質(zhì)分子、分子復(fù)合物或其部 分的結(jié)構(gòu)坐標(biāo)，構(gòu)建未知的結(jié)構(gòu)模型。同源性建?？梢酝ㄟ^擬合蛋白質(zhì)中被解析的三維結(jié) 構(gòu)與已知分子的同源性結(jié)構(gòu)元件的三維結(jié)構(gòu)中共同的或同源的蛋白質(zhì)部分來進(jìn)行，尤其是 使用由本文的圖33和34提供的相關(guān)（即，同源的）結(jié)構(gòu)坐標(biāo)?？梢允褂冒被嵝蛄型?性、同源的次級結(jié)構(gòu)元件和/或同源的三級折疊，來確定同源性。同源性建?？梢园ㄓ靡?解析的相關(guān)結(jié)構(gòu)替代氨基酸（或其他元件），重建部分或全部的三維結(jié)構(gòu)。相應(yīng)的，可以使 用本文描述的CcManSpm的三維結(jié)構(gòu)生成未知分子的三維結(jié)構(gòu)，并使用多種本領(lǐng)域普遍已 知的技術(shù)細(xì)化。
[0162] 基于本文描述的三維結(jié)構(gòu)，可以在CcManSpm或其他甘露糖苷酶的一些原子或側(cè) 基中產(chǎn)生取代，從而改善或修飾它的選擇性。例如，CcMan5在536和588位含有非酸性殘 基，允許甘露糖苷酶的磷酸連接耐受在Man-P-Man底物中的異頭氧。由此，可以將其他甘露 糖苷酶中的相應(yīng)殘基變?yōu)榉撬嵝詺埢?，增加甘露糖苷酶接受Man-P-Man底物的能力。
[0163] 可以通過分析核苷酸和多肽序列比對，鑒別適用于本文中的其他甘露糖苷酶多肽 候選物。例如，在核苷酸或多肽序列的數(shù)據(jù)庫中實(shí)施搜索，可以鑒別甘露糖苷酶多肽的同源 物和/或類似物。序列分析可以涉及使用已知的甘露糖苷酶氨基酸序列對非冗余數(shù)據(jù)庫進(jìn) 行BLAST、相互Reciprocal或PSI-BLAST分析。數(shù)據(jù)庫中那些具有大于40%序列同一性的 多肽可以鑒別為進(jìn)一步評估作為甘露糖苷酶多肽適用的候選物。氨基酸序列相似性允許保 守型氨基酸取代，例如用另一個(gè)疏水性殘基取代一個(gè)疏水性殘基，或者用另一個(gè)極性殘基 取代一個(gè)極性殘基。需要時(shí)，可以人工檢查此類候選物，從而縮小進(jìn)一步評估的候選物數(shù) 量?？梢酝ㄟ^選擇表現(xiàn)出具有這樣的結(jié)構(gòu)域的候選物，來實(shí)施人工檢查，其中所述結(jié)構(gòu)域被 懷疑存在于能夠水解末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接的甘露糖苷酶中，例如一個(gè)或多 個(gè)（例如，1、2、3、4或更多個(gè)）保守的結(jié)構(gòu)域或功能區(qū)（例如，底物結(jié)合空穴）。此類結(jié)構(gòu) 域可包括富含甘氨酸的基序GVGXXGXGG，其中X是Gly、Ser、Thr、Val、Ala、Cys或Gin (或其 他具有小側(cè)鏈的氨基酸）。該基序可見于SEQ ID NO: 50的69-77位殘基。該區(qū)域形成環(huán)， 為-1甘露糖和酶的活性位點(diǎn)中的磷酸-結(jié)合子位點(diǎn)提供了關(guān)鍵性的氫鍵。
[0164] 保守基序的另一個(gè)實(shí)例包括VEXE基序，其中Arg(R)與-1環(huán)，并可能與+1環(huán)形成 氫鍵，Glu(E)處于與該R殘基的鹽鍵橋中，可能使該基序成形；而X是Trp或除Pro以外的 任何氨基酸。該基序可見于SEQ ID N0:50的404-407位殘基。
[0165] 合適的基序還可以是XJ_QGX2基序，其中X丨是Leu、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr或Met, 父 2是1111'、561'或Asn。該基序可見于SEQ IDN0:50的534-538位殘基。該基序中的Gln(Q) 作為E是重要的，存在不具有水解寡糖上的末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接的能力的 甘露糖苷酶中。該基序中的Tyr(Y)被認(rèn)為對+1位點(diǎn)形成而言是重要的。
[0166]此外，由 SEQ ID N0:50 的22、25、71、72、195、196、354、405、535、536、588、589、626、 658、660和662位殘基定義的區(qū)域形成了 CcMan5的底物結(jié)合空穴。作為最低需求，G71、 G72、D355、R405、Q536、N588、Q589、T626、D660、D662 形成了催化中心，其中 N588、Q589 和 D660參與協(xié)調(diào)催化性Ca2+離子，D662和D660參與活化親核的水，Q536穩(wěn)定躍遷狀態(tài)過程 中的異頭氧，而G71、G71、D355、R405和T626參與-1位點(diǎn)的底物結(jié)合。參見圖30關(guān)于最 小催化中心的展示。由此，當(dāng)位于最小的催化中心（例如，圖30所述）的氨基酸側(cè)鏈中的 原子的三維蛋白坐標(biāo)落入距圖33中等價(jià)原子的坐標(biāo)1.5A偏差以內(nèi)時(shí)，可以選擇甘露糖苷 酶作為能夠水解末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接的候選甘露糖苷酶。
[0167] 保守基序還可以是在蛋白質(zhì)的N端結(jié)構(gòu)域中的GDXGN基序，其中X可以是除Pro 以外的任何氨基酸。該基序可見于SEQ ID NO: 50的21-25位殘基，形成酶的部分底物結(jié)合 口袋，如圖24所示。特別的是，D和N的側(cè)鏈框出了底物結(jié)合空穴，并可能形成結(jié)合+1甘 露糖的備選子口袋。
[0168] 如實(shí)施例14所述，在多肽序列的數(shù)據(jù)庫中實(shí)施搜索在下了生物中鑒別 出CcMan5的同源物：天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor) (GenBank登錄號： NP_630514)、變鉛青鏈霉菌（Streptomyces lividans) (GenBank 登錄號：ZP_05522540)、 變鉛青鏈霉菌（GenBank 登錄號：ZP_06527366)、螺狀梭菌（C