lostridium spiroforme) (GenBank 登錄號：ZP_02866543)、多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron) (GenBank 登錄號：NP_812442)、Zunongwangia profunda (GenBank 登錄號： YP_003584502) ;Chitinophaga pinensis (GenBank 登錄號：YP_003120664);類芽孢桿 菌屬（GenBank 登錄號：YP_003013376);擬桿菌屬（GenBank 登錄號：ZP_04848482); Bacteroides cellulosilyticus(GenBank 登錄號：ZP_03677957) ；Leeuwenhoekiella blandensis (GenBank 登錄號：ZP_01061975) ；Sphingobacterium spiritivorum(GenBank 登錄號：ZP_07083984)和土地桿菌屬（GenBank登錄號：ZP_01885202)。天藍(lán)色鏈霉菌和變 鉛青鏈霉菌中的甘露糖苷酶是相似的（與CcMan5GH92結(jié)構(gòu)域66%序列同一性，在765個 BLASTP比對的殘基中有501個相同），不僅在上述基序而且在三維結(jié)構(gòu)的許多環(huán)中。
[0169] 可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生產(chǎn)編碼甘露糖苷酶多肽的分離的核酸分子。例如，可以使 用聚合酶連鎖反應(yīng)（PCR)技術(shù)獲得含有本文所述核苷酸序列的分離的核酸。PCR可用于 從DNA以及RNA中擴(kuò)增特定的序列，包括來自總基因組DNA或總細(xì)胞RNA的序列。一般而 言，來自目標(biāo)區(qū)域末端或遠(yuǎn)端的序列信息被用于設(shè)計與待擴(kuò)增的模板的反向鏈序列相同或 相似的寡核苷酸引物。還可以利用多種P C R對策，其中可以位點特異性的核苷酸序列修 飾導(dǎo)入模板核酸中。還可以化學(xué)合成分離的核酸，不論是作為單個核酸分子（例如，使用 phosphoramidite技術(shù)按3'至5'方向用自動化DNA合成）或作為一系列的寡核苷酸。例 如，可以合成含有所需序列的一個或多個成對的長寡核苷酸（例如，>100個核苷酸），其中 每一對含有互補(bǔ)的短片段（例如，約15個核苷酸），使得將寡核苷酸對退火時形成二聚體。 使用DNA聚合酶延伸寡核苷酸，每個寡核苷酸對獲得單個雙鏈核酸分子，之后可連接成載 體。本發(fā)明的分離的核酸還可以通過誘變例如天然存在的DNA而獲得。
[0170] 本文件還提供了本文描述的甘露糖苷酶的（i)生物學(xué)活性的變體和（ii)生物學(xué) 活性的片段或其生物學(xué)活性的變體。相對于SEQ ID勵8:7、9、11、13、15或50所述的序列， 甘露糖苷酶的生物學(xué)活性的變體可以含有添加、刪除或取代。含取代的蛋白一般具有不超 過 50 個（例如，不超過 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40或50個）保守氨基 酸取代。保守取代是用具有相似特征的另一個氨基酸取代一個氨基酸。保守取代包括以下 組中的取代：纈氨酸、丙氨酸和甘氨酸；亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天 冬酰胺和谷氨酰胺；絲氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸；賴氨酸和精氨酸；和苯丙氨酸和酪氨酸。 非極性的疏水性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸 和甲硫氨酸。極性的中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺 和谷氨酰胺。正電荷（堿性）氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。負(fù)電荷（酸性）氨基 酸包括天冬氨酸和谷氨酸。上述極性、堿性或酸性組中的一個成員被另一個同組成員的任 意取代都可視為保守取代。相反，非保守取代是用具有不相似特征的另一個氨基酸取代一 個氨基酸。圖31和32所述的序列比對提供了進(jìn)行多個氨基酸取代的實例。
[0171]缺失變體可以缺少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個氨基酸片段（2個或多個氨基酸）或非連續(xù)的單個氨基酸。
[0172] 添加（添加變體）包括這樣的融合蛋白，所述融合蛋白含有：（a)SEQ ID NOs :7、 9、11、13或15所述甘露糖苷酶，或其片段；和（b)內(nèi)部或末端（C或N)的不相關(guān)或異源的 氨基酸序列。在此類融合蛋白的語境中，術(shù)語"異源的氨基酸序列"指除（a)以外的氨基酸 序列。異源序列可以是例如用于純化重組蛋白的序列（例如，F(xiàn)LAG、多聚組氨酸（例如，六 組氨酸）、gluttanin(HA)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)或麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP))。異源序 列還可以是用作診斷的蛋白或可檢測的標(biāo)志物，例如，熒光素酶、綠色熒光蛋白（GFP)或氯 霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT)。在一些實施方案中，融合蛋白含有來自另一種蛋白質(zhì)的信號序列。 在某些宿主細(xì)胞（例如，酵母宿主細(xì)胞）中，可以通過使用異源信號序列增加靶蛋白的表達(dá) 和/或分泌。在一些實施方案中，融合蛋白可以含有載體（例如，KLH，可用于例如引發(fā)免疫 應(yīng)答產(chǎn)生抗體），或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體細(xì)胞器的滯留信號。異源序列的長度可以改變，在 一些情況下可以是比異源序列連接的全長靶蛋白更長的序列。
[0173] 甘露糖苷酶的生物學(xué)活性片段或生物學(xué)活性變體具有野生型、全長、成熟蛋白質(zhì) 的至少 40% (例如，至少 50% ;60% ;70% ;75% ;80% ;85% ;90% ;95% ;97% ;98% ;99% ; 99. 5%或100%或甚至更高的）甘露糖苷酶活性（例如，脫帽M6P殘基）。例如，甘露糖苷 酶的生物學(xué)活性片段可含有SEQ ID NO: 50的1-774位殘基。
[0174] 本文描述的甘露糖苷酶可用于生產(chǎn)具有脫帽末端磷酸-6-甘露糖（M6P)殘基的分 子（例如，靶蛋白）。方法可以在體外或體內(nèi)實施。
[0175] 脫帽（uncapping)M6P殘基的體外方法
[0176] 本文描述的甘露糖苷酶可以是重組生產(chǎn)的，用于在體外脫帽/打開（uncapping) 寡糖上的M6P殘基。為了重組生產(chǎn)甘露糖苷酶，使用含有與編碼甘露糖苷酶多肽的核酸有 效連接的啟動子的載體。在本文中，"啟動子"指能夠使基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。啟動子被RNA 聚合酶識別，之后起始轉(zhuǎn)錄。因而，啟動子含有被RNA聚合酶直接結(jié)合或涉及募集RNA聚合 酶的DNA序列。啟動子序列還可以包括"增強(qiáng)子區(qū)"，這是一個或多個可以結(jié)合蛋白質(zhì)（即， 反式作用因子，大部分類似轉(zhuǎn)錄因子）來增強(qiáng)基因簇中的基因轉(zhuǎn)錄水平（由此得名）的DNA 區(qū)域。增強(qiáng)子通常位于編碼區(qū)的5'區(qū)，也可以與啟動子序列分隔，例如可以位于基因的內(nèi) 含子區(qū)域或基因編碼區(qū)的3'。
[0177] 在本文中，"有效連接"意指整合到遺傳構(gòu)建體（例如，載體）中，使得表達(dá)控制序 列有效的控制目標(biāo)編碼序列的表達(dá)。
[0178] 可以將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞（例如，通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染）中，用于表達(dá)編碼的多 肽，之后可以純化所述多肽?？捎糜谛∫?guī)模或大規(guī)模生產(chǎn)甘露糖苷酶多肽的表達(dá)系統(tǒng)包括 但不限于微生物，例如用含有核酸分子的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化的細(xì)菌（例如，E. coli)，和用含有核酸分子的重組真菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的真菌（例如，釀酒 酵母、解脂耶氏酵母、Arxula adeninivorans、畢赤酵母、多形漢遜酵母或曲霉）。有效的表 達(dá)系統(tǒng)還包括用含有核酸分子的重組病毒表達(dá)載體（例如，桿狀病毒）感染的昆蟲細(xì)胞系 統(tǒng)，和用含有核酸分子的重組病毒表達(dá)載體（例如，煙草花葉病毒）感染的或用重組質(zhì)粒表 達(dá)載體（例如，Ti質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞細(xì)胞。還可以使用哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)甘露糖 苷酶多肽，所述表達(dá)系統(tǒng)包括錨定了重組表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞（例如，永生化細(xì)胞系，如C0S 細(xì)胞、中華田鼠卵巢細(xì)胞、Hela細(xì)胞、人胎腎293細(xì)胞和3T3L1細(xì)胞），所述構(gòu)建體沿著本文 描述的核酸含有源自哺乳動物細(xì)胞基因組（例如，金屬硫蛋白啟動子）或來自別哺乳動物 病毒（例如，腺病毒晚期啟動子和巨細(xì)胞病毒啟動子）的啟動子。
[0179] 通常，用幫助純化蛋白質(zhì)的異源氨基酸序列標(biāo)記重組的甘露糖苷酶多肽，例如 FLAG、多聚組氨酸（例如，六組氨酸）、gluttanin(HA)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)或麥 芽糖結(jié)合蛋白（MBP)。純化蛋白質(zhì)的其他方法包括層析技術(shù)，例如離子交換層析、疏水和 逆向?qū)游?、尺寸排阻層析、親和層析、疏水電荷誘導(dǎo)層析等（參見例如，Scopes, Protein Purification ：Principles and Practice,第 3 版，Springer-Verlag, New York (1993)； Burton 和 Harding, J. Chromatogr. A 814:71-81(1998))。
[0180] 為了在體內(nèi)生產(chǎn)具有脫帽末端M6P的分子，在合適的條件下將含有甘露糖-1-磷 酸-6-甘露糖連接的靶分子與純化的甘露糖苷酶或含有重組生產(chǎn)的甘露糖苷酶的細(xì)胞裂 解物接觸。細(xì)胞裂解物可來自遺傳改造過的細(xì)胞，包括真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞。動 物細(xì)胞的非限制性實例包括線蟲、昆蟲、植物、鳥、爬行動物和哺乳動物，例如小鼠、大鼠、 兔、田鼠、沙鼠、狗、貓、山羊、豬、牛、馬、鯨、猴或人。在將靶分子（例如寡糖或糖蛋白）與純 化的甘露糖苷酶或含有重組生產(chǎn)的甘露糖苷酶的細(xì)胞裂解物接觸的基礎(chǔ)上，甘露糖苷酶水 解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接，并產(chǎn)生具有一個或多個脫帽末端M6P殘基的靶分子。 實施例2中描述的方法可用于確定是否已經(jīng)脫帽了末端M6P殘基。在通過甘露糖苷酶加工 后，可以分離已脫帽末端M6P殘基的靶分子。
[0181]用于獲得細(xì)胞裂解物并保持裂解物中的甘露糖苷酶的活性或完整性的合適方法 可以包括使用恰當(dāng)?shù)木彌_液和/或抑制劑，包括保持或使細(xì)胞裂解物中的N糖基化活性變 化最小化的核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制劑。此類抑制劑包括例如螯合劑，如乙二胺四乙 酸（EDTA)、聚乙二醇二（P-氨乙基乙酯）N，N，N1，N1-四乙酸（EGTA)，蛋白酶抑制劑例如苯 甲基磺酸氟化物（PMSF)、aprotinin、leupeptin、antipain等，磷酸酶抑制劑如磷酸鹽、氟 化鈉、釩酸鹽等。獲得含有酶活性的裂解物的恰當(dāng)緩沖液和條件描述在例如Ausubel等 人，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47), John ffiley&Sons, New York(1999) ;Harlow 和 Lane, Antibodies :A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988) ;Harlow和 Lane,Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(1999) ；Tietz Textbook of Clinical Chemistry,第 3 版，Burtis 和 Ashwood 編著，W.B. Saunders, Philadelphia, (1999)中。
[0182] 需要時，可以進(jìn)一步加工細(xì)胞裂解物，消除或最小化存在的干擾物質(zhì)。需要時， 可以通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的方法將細(xì)胞裂解物分級，包括亞細(xì)胞分級，和層 析技術(shù)，例如離子交換層析、疏水和逆向?qū)游?、尺寸排阻層析、親和層析、疏水電荷誘導(dǎo)層析 等。
[0183] 在一些實施方案中，可以制備細(xì)胞的細(xì)胞器仍然完整和/或有功能的細(xì)胞裂解 物。例如，含有一個或多個完整的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、完整的光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或完整的高爾基體配置 的裂解物。制備含有完整的細(xì)胞器和用于測試細(xì)胞器功能性的裂解物的合適方法描述在 例如：Moreau 等人，（1991) J. Biol. Chem. 266 (7) : 4329-4333 ;Moreau 等人，（1991) J. Biol. Chem. 266(7) :4322-4328 ;Rexach等人，（1991) J. Cell Biol. 114(2) :219-229 ;和Paulik等 人，（1999) Arch. Biochem. Biophys. 367(2) : 265-273 中。
[0184] 靶分子在本文中指任何含有末端甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接的分子，或者當(dāng) 在真菌來源的細(xì)胞中表達(dá)時，含有甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖連接的任何分子。合適的 革巴分子包括病原體蛋白，例如破傷風(fēng)類毒素或白喉類毒素；病毒表面蛋白，例如巨細(xì)胞病 毒（CMV)糖蛋白B、H和gCIII，人免疫缺陷病毒（HIV-1)衣殼糖蛋白，勞氏肉瘤病毒（RSV) 衣殼糖蛋白，單純皰疹病毒（HSV)衣殼糖蛋白，Epstein Barr病毒（EBV)衣殼糖蛋白， varicella-zoster病毒（VZV)衣殼糖蛋白，人乳頭瘤病毒（HPV)衣殼糖蛋白，流感病毒糖 蛋白和肝炎家族表面抗原；溶酶體蛋白（例如，酸性a葡萄糖苷酶、a半乳糖苷酶、葡糖 腦苷脂酶、腦苷脂酶或半乳糖腦苷脂酶）；胰島素；胰高血糖素；生長因子；細(xì)胞因子；趨化 因子；和抗體或其片段。生長因子包括例如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)、胰島素樣生長因子 (IGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激 因子（GM-CSF)、神經(jīng)生長因子（NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)素、血小板來源的生長因子（PDGF)、紅細(xì)胞 生成素（EP0)、Thrombopoietin (TP0)、Myostatin (⑶F-8)、生長分化因子-9 (⑶F9)、堿性成 纖維細(xì)胞生長因子（bFGF或FGF2)、表皮生長因子（EGF)、肝細(xì)胞生長因子（HGF)。細(xì)胞因子 包括例如白介素，如 IL-1 至 IL-33(例如，IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、 IL-9、IL-10、IL-12、IL-13 或 IL-15)。趨化因子包括例如 1-309、TCA-3、MCP-1、MIP-1 a、 MIP-1P、RANTES、C10、MRP-2、MARC、MCP-3、MCP-2、MRP-2、CCF18、MIP-1y、Eotaxin、MCP-5、 MCP-4、NCC-1、Ck P 10、HCC-1、Leukotactin-1、LEC、NCC-4、TARC、PARC 或 Eotaxin-2。還包 括腫瘤糖蛋白（例如，腫瘤相關(guān)抗原），例如，癌胚抗原（CEA)、人粘液素、HER-2/neu和前列 腺特異性抗原（PSA) (Henderson和 Finn, Advances in Immunology，62，pp. 217-56 (1996))。
[0185] 在一些實施方案中，靶蛋白可以是與溶酶體貯積癥相關(guān)的，所述靶蛋白包括例如 酸性a葡萄糖苷酶、a半乳糖苷酶、a -L-艾杜糖苷酸酶、0 -D-半乳糖苷酶、0 -葡萄糖 苷酶、3 -氨基己糖苷酶、3 -D-甘露糖苷酶、a -L-巖藻糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸 酯酶A、a-N乙酰氨基半乳糖苷酶、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、艾杜糖酸（iduronate)-2-硫 酸酯酶、a -葡萄糖胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、P -D-葡萄糖酸酶、透明質(zhì)酸酶、a -L-甘露糖苷酶、 a -神經(jīng)氨酸苷酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、酸性脂肪酶、酸性神經(jīng)酰胺酶、神經(jīng)磷脂酶、硫酯酶、組織蛋 白酶K和脂蛋白脂肪酶。
[0186] 在一些實施方案中，靶蛋白是融合蛋白，其中靶蛋白與另一種多肽序列、或與聚合 物、載體、佐劑、免疫毒素或可檢測的部分（例如，熒光素、冷光素或放射性）融合。例如，靶 蛋白可以與聚合物（例如，聚乙二醇）連接，增加小蛋白的分子量和/或增加循環(huán)駐留時 間。
[0187] 脫帽M6P殘基的體內(nèi)方法
[0188] 本文描述的遺傳改造過的細(xì)胞可用于生產(chǎn)含有脫帽M6P殘基的靶分子。例如，基 于細(xì)胞的方法可以包括導(dǎo)入遺傳改造過的真菌細(xì)胞中，使得包括編碼甘露糖苷酶的核酸、 編碼靶分子的核酸，其中細(xì)胞生產(chǎn)含有脫帽末端M6P殘基的靶分子。在一些實施方案中，編 碼甘露糖苷酶和靶分子的核酸含有分泌序列，使得甘露糖苷酶和靶分子共同分泌。
[0189] 本文描述的遺傳改造過的細(xì)胞含有編碼甘露糖苷酶的核酸，可用于產(chǎn)生一種或 多種具有脫帽末端M6P殘基的靶分子。適合體內(nèi)生產(chǎn)脫帽末端M6P殘基的細(xì)胞可以是 真菌來源的，包括解脂耶氏酵母、Arxula adeninivorans、甲基營養(yǎng)型酵母（例如，假絲 酵母屬、漢遜酵母屬、Oogataea、畢赤酵母屬或隱球酵母屬的甲基營養(yǎng)型酵母）或者曲霉 屬、木霉屬、鏈胞霉屬、鐮刀霉屬或金孢子菌屬的絲狀真菌。示例性的真菌物種包括但不 限于 Pichia anomala、Pichia bovis、Pichia canadensis、Pichia carsonii、Pichia farinose、Pichia fermentans、Pichia fluxuum、Pichia membranaefaciens、Pichia membranaefaciens、 Candida valida、 Candida albicans、 Candida ascalaphidarum、 Candida amphixiae、Candida Antarctica、Candida atlantica、Candida atmosphaerica、 Candida blattae^Candida carpophila^Candida cerambycidarum^Candida chauliodes^ Candida corydalis^ Candida dosseyi^ Candida dubliniensis^ Candida ergatensis^ Candida fructus^ Candida glabrata^ Candida fermentati^ Candida guilliermondii^ Candida haemulonii^Candida insectamens^Candida insectorunuCandida intermedia^ Candida jeffresii^ Candida kefyiN Candida krusei^ Candida lusitaniae^ Candida lyxosophila、Candida maltosa、Candida membranifaciens、Candida milleri、Candida oleophila、 Candida oregonensis、 Candida parapsilosis、 Candida quercitrusa、 Candida shehatea、Candida temnochilae、Candida tenuis、Candida tropical is、 Candida tsuchiyae、Candida sinolaborantium、Candida sojae、Candida viswanathii、 Candida utilis、Oogataea minuta、Pichia membranaefaciens、Pichia silvestris、 Pichia membranaefaciens、Pichia chodati、Pichia membranaefaciens、Pichia menbranaefaciens、Pichia minuscule、Pichia pastoris、Pichia pseudopolymorpha、 Pichia quercuum、Pichia robertsii、Pichia saitoi、Pichia silvestrisi、Pichia strasburgensis、 Pichia terricola、 Pichia vanriji、 Pseudozyma Antarctica、 Rhodosporidium toruloides、 Rhodotorula glutinis、 Saccharomyces bayanus、 Saccharomyces bayanus、 Saccharomyces momdshuricus、 Saccharomyces uvarum、 Saccharomyces bayanus、 Saccharomyces cerevisiae、 Saccharomyces bisporus、 Saccharomyces chevalieri、 Saccharomyces delbrueckii^ Saccharomyces exiguous、 Saccharomyces fermentati、 Saccharomyces fragilis、 Saccharomyces marxianus、 Saccharomyces mellis、 Saccharomyces rosei、 Saccharomyces rouxii、 Saccharomyces uvarum、 Saccharomyces willianus、 Saccharomycodes ludwigii、 Saccharomycopsis capsularis、 Saccharomycopsis fibuligera、 Saccharomycopsis fibuligera、Endomyces hordei