糖綴合方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 概括而言，本發(fā)明涉及通過(guò)使用TEMPO/NCS作為氧化物質(zhì)（oxidizing agent)來(lái) 制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物（glycoconjugate)的方法、包含此類糖綴合物 的免疫原性組合物以及使用此類糖綴合物和免疫原性組合物的方法。本發(fā)明還涉及通過(guò)在 選擇性氧化糖的伯羥基的氧化劑的存在下使用穩(wěn)定的硝?；虻酰╪itroxide)自由基 (例如哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基）化合物制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物 的方法、包含此類糖綴合物的免疫原性組合物以及使用此類糖綴合物和免疫原性組合物的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 使用與蛋白載體連接的多糖（通常來(lái)自細(xì)菌的表面包衣）制備多糖蛋白綴合物疫 苗。多糖與蛋白載體的化學(xué)鍵合誘導(dǎo)針對(duì)在其表面上展現(xiàn)疫苗內(nèi)所包含的多糖的細(xì)菌的免 疫應(yīng)答，由此預(yù)防疾病。因此，使用來(lái)自致病細(xì)菌的多糖的疫苗接種是增強(qiáng)宿主免疫力的潛 在策略。覆蓋細(xì)菌的多糖大為不同，甚至在單一細(xì)菌物種內(nèi)也是如此。例如，在肺炎鏈球菌 (Streptococcus pneumoniae，全世界范圍內(nèi)嬰兒和幼兒的腦膜炎、肺炎及嚴(yán)重的侵襲性疾 病的主要誘因）中，由于細(xì)菌多糖包衣的變化而具有超過(guò)90種不同的血清型。因此，多糖 疫苗通常由一組多糖組成以增加保護(hù)。
[0003] 盡管多糖自身是免疫原性的，但多糖與蛋白載體的綴合已用于改善免疫原性。載 體蛋白可以是來(lái)自靶標(biāo)病原體的增強(qiáng)對(duì)該病原體的特異性免疫應(yīng)答的相關(guān)蛋白抗原，或是 主要作為佐劑或一般免疫應(yīng)答刺激劑的一般免疫原性蛋白。
[0004] 多價(jià)肺炎球菌多糖-蛋白綴合物疫苗已經(jīng)被許可多年，并且已證明在預(yù)防嬰兒的 肺炎球菌疾病方面是有價(jià)值的，并且最近已經(jīng)推薦用于成人。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物的方法，其 包括以下步驟：a)使糖與2, 2, 6, 6-四甲基-1-哌啶氧基（TEMPO)和N-氯代琥珀酰亞胺 (NCS)在水性溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生活化的糖；以及b)使所述活化的糖與包含一個(gè)或多個(gè)氨基 的載體蛋白反應(yīng)。在另一方面，所述活化的糖的氧化度為1至50、1至40、1至30、1至20、 1 至 10、1 至 5、3 至 40、3 至 30、3 至 20、3 至 10、4 至 40、4 至 30、4 至 20、4 至 10、5 至 30、 5 至 25、5 至 20、5 至 10、6 至 50、6 至 40、6 至 30、6 至 20、6 至 15、6 至 14、6 至 13、6 至 12、 6 至 11、6 至 10、7 至 40、7 至 30、7 至 20、7 至 15、7 至 14、7 至 13、7 至 12、7 至 11、7 至 10、 8 至 40、8 至 30、8 至 20、8 至 15、8 至 14、8 至 13、8 至 13、8 至 12、8 至 11、8 至 10、9 至 40、9 至30、9至20、9至15、10至40、10至30、10至20或10至15。在另一方面，所述活化的糖 的氧化度為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40。
[0006] 在另一方面，本發(fā)明提供了制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物的方法，其 包括以下步驟：a)在選擇性氧化糖的伯羥基的氧化劑的存在下，使所述糖與穩(wěn)定的硝酰基 或氮氧自由基化合物如哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物反應(yīng)以產(chǎn)生包含醛基的活化 的糖；以及b)使所述活化的糖與包含一個(gè)或多個(gè)氨基的載體蛋白反應(yīng)。
[0007] 在所述反應(yīng)中，實(shí)際的氧化劑為催化性循環(huán)的N-氧代按鹽（N-oxoammonium salt)。優(yōu)選地，所述穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔锞哂性谘趸瘎┑拇嬖谙聦⒉歼x擇 性氧化成醛而不過(guò)度氧化成羧酸的能力。
[0008] 在一方面，反應(yīng)的步驟a)在水性溶劑中進(jìn)行。在另一方面，步驟a)在非質(zhì)子溶劑 中進(jìn)行。在一方面，步驟a)在DMS0 (二甲亞砜）、二甲基乙酰胺（DMA)、環(huán)丁砜、N-甲基-2-吡 咯烷酮（NMP)、六甲基磷酰胺（HMPA)中或在DMF(二甲基甲酰胺）溶劑中進(jìn)行。
[0009] 在一方面，未反應(yīng)的醛基在與載體蛋白綴合之后使用硼氫化物在加帽步驟中被轉(zhuǎn) 化回伯醇，由此使在涉及氧化及隨后的綴合的修飾步驟期間的糖表位修飾最小化。
[0010] 在一方面，所述穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔锸沁哙?N-氧基或吡咯 烷-N-氧基化合物。優(yōu)選地，所述化合物具有在氧化劑的存在下選擇性氧化伯醇以生成醛 基而不影響仲羥基的能力。更優(yōu)選地，所述化合物具有在氧化劑的存在下選擇性氧化伯醇 以生成醛基而不過(guò)度氧化成羧基的能力。
[0011] 在一方面，所述穩(wěn)定的硝酰基或氮氧自由基化合物帶有TEMPO或 PR0XYL (2, 2, 5, 5-四甲基-1-吡咯烷氧基）部分。優(yōu)選地，所述化合物具有在氧化劑的存在 下選擇性氧化伯醇以生成醛基而不影響仲羥基的能力。更優(yōu)選地，所述化合物具有在氧化 劑的存在下選擇性氧化伯醇以生成醛基而不過(guò)度氧化成羧基的能力。
[0012] 在一方面，所述穩(wěn)定的硝?；衔锸荰EMPO或其衍生物。在一個(gè)方面，所述穩(wěn) 定的硝?；衔镞x自TEMP0、2,2,6,6-四甲基_4_(甲基磺酰氧基）-1_哌啶氧基、4-膦 酰氧基-TEMPO、4_氧代-TEMPO、4_甲氧基-TEMPO、4_異硫氰酸基-TEMPO、4-(2_碘乙酰 氨基）-TEMPO自由基、4-羥基-TEMPO、4_氰基-TEMPO、4_羧基-TEMPO、4_(2-溴乙酰氨 基）-161^0、4-氨基1￡1^0、4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基。優(yōu)選地，所述硝 酰基化合物是TEMPO。
[0013] 在另一方面，所述穩(wěn)定的硝?；衔镞x自3 0 -DOXYL-5 a -膽留烷、5-D0XYL-硬 脂酸、16-D0XYL-硬脂酸、5-D0XYL-硬脂酸甲酯、3-(氨基甲基）-PR0XYU3-氨甲酰 基-PR0XYU3-氨甲?；?2, 2, 5, 5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧基、3-羧基-PR0XYU3-氰 基-PR0XYL。
[0014] 在一個(gè)方面，所述氧化劑是帶有N-鹵代部分的分子。優(yōu)選地，所述分子具有在硝 酰基化合物的存在下選擇性氧化伯醇的能力。
[0015] 在一個(gè)方面，所述氧化劑選自N-氯代琥珀酰亞胺、N-溴代琥珀酰亞胺、N-碘 代瑭I自酰亞胺、二氯異氛尿酸、1，3, 5-二氯-1，3, 5-二嘆-2, 4, 6-二酮、二溴異氛尿酸、 1，3, 5-三溴-1，3, 5-三嗪-2, 4, 6-三酮、二碘異氰尿酸以及1，3, 5-三碘-1，3, 5-三 嗪-2, 4, 6-三酮。優(yōu)選地，所述氧化劑為N-氯代琥珀酰亞胺。
[0016] 在一方面，所述活化的糖的氧化度為1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至 5、3 至 40、3 至 30、3 至 20、3 至 10、4 至 40、4 至 30、4 至 20、4 至 10、5 至 30、5 至 25、5 至 20、 5 至 10、6 至 50、6 至 40、6 至 30、6 至 20、6 至 15、6 至 14、6 至 13、6 至 12、6 至 11、6 至 10、 7 至 40、7 至 30、7 至 20、7 至 15、7 至 14、7 至 13、7 至 12、7 至 11、7 至 10、8 至 40、8 至 30、 8 至 20、8 至 15、8 至 14、8 至 13、8 至 13、8 至 12、8 至 11、8 至 10、9 至 40、9 至 30、9 至 20、9 至15、10至40、10至30、10至20或10至15。在另一方面，所述活化的糖的氧化度為1、2、 3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40。
[0017] 在一方面，所述糖與0. 1至10摩爾當(dāng)量的所述氧化劑反應(yīng)。優(yōu)選地，所述糖與0.2 至5、0. 5至2. 5或0. 5至1. 5摩爾當(dāng)量的所述氧化劑反應(yīng)。在一方面，所述多糖與約0. 2、 0? 4、0. 6、0. 8、1、1. 2、1. 4、1. 6、1. 8、2、2. 2、2. 4、2. 6、2. 8、3、3. 2、3. 4、3. 6、3. 8、4、4. 2、4. 4、 4. 6、4. 8或5摩爾當(dāng)量的所述氧化劑反應(yīng)。
[0018] 在一方面，所述穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔镆源呋看嬖凇Ｔ谝环矫?，所述 糖與少于約0. 3摩爾當(dāng)量的穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔锓磻?yīng)。在一方面，所述糖與 少于約0. 005摩爾當(dāng)量的穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔锓磻?yīng)。在一方面，所述糖與約 0. 005、0. 01、0. 05或0. 1摩爾當(dāng)量的穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫衔锓磻?yīng)。
[0019] 在另一方面，所述糖是細(xì)菌莢膜多糖。在另一方面，所述糖是合成得到的寡糖或 多糖。在一個(gè)方面，所述莢膜多糖源自肺炎鏈球菌（Pn)。在另一方面，所述莢膜多糖選自 Pn-血清型10A、Pn-血清型12F和Pn-血清型33F莢膜多糖。例如，在一方面，所述莢膜多 糖是Pn-血清型12F莢膜多糖。
[0020] 在另一方面，所述莢膜多糖源自腦膜炎奈瑟氏球菌（N. meningitidis)。在一個(gè)方 面，所述莢膜多糖選自腦膜炎球菌（Mn)_血清型A、C、W135和Y莢膜多糖。
[0021] 在另一方面，所述莢膜多糖是腦膜炎球菌（Mn)_血清型X莢膜多糖。
[0022] 在另一方面，所述莢膜多糖源自B組鏈球菌（Group B Streptococcus，GBS)。在 一方面，所述莢膜多糖選自GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII。
[0023] 在一方面，本發(fā)明提供了本文所公開的任何方法，其中所述載體蛋白是來(lái)自 破傷風(fēng)、白喉、百日咳、假單胞菌屬（Pseudomonas)、大腸桿菌（E. col i)、葡萄球菌屬 (Staphylococcus)或鏈球菌屬（Streptococcus)的毒素。在一方面，所述載體蛋白是 CRM 197〇
[0024] 在另一方面，本發(fā)明提供了本文所述的方法，其中在步驟a)之前，將所述糖水解 至100kDa至400kDa的分子量。例如，在一方面，所述分子量為100kDa至350kDa、100kDa至 300kDa、100kDa 至 250kDa、100kDa 至 200kDa、100kDa 至 150kDa、200kDa 至 400kDa、200kDa 至 350kDa、200kDa 至 300kDa、200kDa 至 250kDa、300kDa 至 400kDa、或 300kDa 至 350kDa。
[0025] 在另一方面，本發(fā)明提供了本文提供的任何方法，其還包括在步驟b)之前純化所 述活化的多糖的步驟。在另一方面，所述方法還包括在步驟b)之后添加還原劑的步驟。 在一方面，所述還原劑為NaCNBH 3。在另一方面，所述方法還包括在添加NaCNBH32后添加 NaBH4的步驟。在另一方面，所述方法包括在添加NaBH 4之后的純化步驟。
[0026] 在另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)本文所公開的任何方法而產(chǎn)生或可獲得的糖綴合 物。例如，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)包括以下步驟的方法產(chǎn)生或可獲得的包含與載體 蛋白綴合的糖的糖綴合物：a)使糖與2, 2, 6, 6-四甲基-1-哌啶氧基（TEMPO)和N-氯代琥 珀酰亞胺（NCS)在水性溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生活化的糖；以及b)使所述活化的糖與包含一個(gè)或 多個(gè)氨基的載體蛋白反應(yīng)。在另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)包括以下步驟的方法產(chǎn)生或可 獲得的包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物：a)使糖與穩(wěn)定的硝?；虻踝杂苫?物和氧化劑反應(yīng)以產(chǎn)生包含醛基的活化的糖；以及b)使所述活化的糖與包含一個(gè)或多個(gè) 氨基的載體蛋白反應(yīng)。穩(wěn)定的硝?；衔锖脱趸瘎┛梢匀缟衔乃x。
[0027]在另一方面，本發(fā)明提供了包含本文所公開的任何糖綴合物以及藥學(xué)上可接受的 賦形劑、載體或稀釋劑的免疫原性組合物。在另一方面，所述免疫原性組合物包含其它抗 原。在另一方面，所述其它抗原包括蛋白抗原或源自肺炎鏈球菌的莢膜多糖的糖綴合物。 例如，在一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖選自Pn_血清型1、 3、4、5、6六、68、7卩、8、叭、1認(rèn)、14、158、18(：、19六、19卩、22?和23卩莢膜多糖。在另一方面，所述 其它抗原包括蛋白抗原或源自腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖的糖綴合物。在另一方面，所 述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖選自血清型A、C、W135和Y莢膜多糖。 在另一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖來(lái)自血清型X莢膜多 糖。在另一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖源自B組鏈球菌 (GBS)。在一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖選自GBS血清型 Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII 和 VIII。
[0028]在另一方面，本發(fā)明提供了本文所公開的任何免疫原性組合物，其還包含佐劑。在 一方面，所述佐劑是鋁系佐劑。在另一方面，所述鋁系佐劑選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。
[0029]在另一方面，本發(fā)明提供了預(yù)防、治療或改善個(gè)體的細(xì)菌感染、疾病或病癥的方 法，其包括向所述個(gè)體給藥免疫有效量的本文所公開的任何免疫原性組合物。在一方面，所 述感染、疾病或病癥與肺炎鏈球菌相關(guān)。在一方面，所述感染、疾病或病癥與腦膜炎奈瑟氏 球菌相關(guān)。
[0030]在另一方面，本發(fā)明提供了在個(gè)體中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述 個(gè)體給藥免疫有效量的本文所公開的任何免疫原性組合物。
[0031]在另一方面，本發(fā)明提供了包含與載體蛋白綴合的Pn-血清型12F的免疫原性 組合物，其中所述綴合物是穩(wěn)定的。例如，在一方面，本發(fā)明提供了包含與載體蛋白綴合 的Pn-血清型12F的免疫原性組合物，其中從其制備時(shí)起120天之后，所述組合物中游離 Pn-血清型12F多糖的量少于35%。在另一方面，從其制備時(shí)起120天之后，游離Pn-血清 型12F多糖的量少于30%、少于28%、少于27%、少于26%、或少于25%。在另一方面，從 其制備時(shí)起90天之后，游離Pn-血清型12F多糖的量少于35%、少于30%、少于28%、少于 27%、少于26%、或少于25%。在另一方面，從其制備時(shí)起60天之后，游離Pn-血清型12F 多糖的量少于35%、少于30%、少于28%、少于27%、少于26%、或少于25%。在另一方面， 從其制備時(shí)起30天之后，游離Pn-血清型12F多糖的量少于35%、少于30 %、少于28%、少 于27 %、少于26 %、或少于25 %。在另一方面，本發(fā)明提供了包含與載體蛋白綴合的Pn-血 清型3、10A或33F的組合物，其中從其制備時(shí)起120天之后，所述組合物中游離Pn-血清型 3、10A或33F多糖的量分別少于35%。在另一方面，從其制備時(shí)起120天之后，游離Pn-血 清型3、10A或33F多糖的量少于30%、少于28%、少于27%、少于26%、或少于25%。在 另一方面，從其制備時(shí)起90天之后，游離Pn-血清型3、10A或33F多糖的量少于35%、少 于30%、少于28%、少于27%、少于26%、或少于25%。在另一方面，從其制備時(shí)起60天之 后，游離Pn-血清型3、10A或33F多糖的量少于35%、少于30%、少于28%、少于27%、少 于26%、或少于25%。在另一方面，從其制備時(shí)起30天之后，游離Pn-血清型3、10A或33F 多糖的量少于35%、少于30%、少于28%、少于27%、少于26%、或少于25%。在一方面， 上文所討論的游離多糖的量是在25°C下測(cè)量的。在一方面，上文所公開的組合物中的載體 蛋白是來(lái)自來(lái)自破傷風(fēng)、白喉、百日咳、假單胞菌、大腸桿菌、葡萄球菌或鏈球菌的毒素。在 另一方面，所述載體蛋白是crm197。
[0032] 本發(fā)明還提供了包含上文所公開的任何此類糖綴合物以及藥學(xué)上可接受的賦形 劑、載體或稀釋劑的免疫原性組合物。在另一方面，此類免疫原性組合物包含其它抗原。例 如，在另一方面，所述其它抗原包括蛋白抗原或源自肺炎鏈球菌的莢膜多糖的糖綴合物。在 一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖選自Pn-血清型1、3、4、5、 6A、6B、7F、8、9V、11A、14、15B、18C、19A、19F、22F 和 23F 莢膜多糖。在另一方面，所述其它抗 原包括蛋白抗原或源自腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖的糖綴合物。在另一方面，所述其它 抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖選自血清型A、C、W135和Y莢膜多糖。在另一 方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖來(lái)自血清型X莢膜多糖。在另 一方面，所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合物，所述莢膜多糖來(lái)自B組鏈球菌（GBS)。在 一方面，所述莢膜多糖選自GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII。
[0033] 在另一方面，此類免疫原性組合物還包含佐劑。例如，在一方面，所述佐劑是鋁系 佐劑。在另一方面，所述鋁系佐劑選自磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1示出Pn-血清型12F的莢膜多糖的結(jié)構(gòu)。
[0035] 圖2示出N-氯代瑭J白酰亞胺在Tempo/NCS氧化（oxidationation)反應(yīng)中對(duì)氧化 度（DO)的依賴性。
[0036] 圖3示出Pn-血清型10A的莢膜多糖的結(jié)構(gòu)。
[0037] 圖4示出Pn-血清型33F的莢膜多糖的結(jié)構(gòu)。
[0038] 圖5示出Pn-血清型3的莢膜多糖的結(jié)構(gòu)。
[0039] 圖6示出使用TEMP0/NCS氧化/綴合Pn-血清型12F的推定機(jī)制。
[0040] 圖7示出使用高碘酸鹽氧化相對(duì)于使用TEMP0/NCS氧化所制備的Pn-血清型12F 的穩(wěn)定性比較。
[0041] 發(fā)明詳述
[0042] 通過(guò)參考本發(fā)明的各種實(shí)施方案的以下詳細(xì)說(shuō)明和本文中所包括的實(shí)施例可以 更容易地理解本發(fā)明。除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都與本發(fā) 明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的含義相同。雖然本文中描述了某些優(yōu)選方法和材料，但 類似或等同于本文所述的那些的任何方法和