反應(yīng)時(shí)間為3小時(shí)。
[0184] 實(shí)施例4 :綴合物純化
[0185] 使用5 ym過(guò)濾器過(guò)濾加帽的反應(yīng)混合物,然后使用100K MWC0超濾膜純化。首先 使用10mM琥珀酸鹽/0. 9 %鹽水,pH 6. 0緩沖液滲濾綴合物。然后,將純化的綴合物通過(guò) 0. 45/0. 22 y m過(guò)濾器過(guò)濾以獲得大量綴合物。
[0186] 實(shí)施例5:氧化度
[0187] 使用TEMP0/NCS體系實(shí)現(xiàn)血清型12F多糖中伯醇的成功氧化。通過(guò)調(diào)節(jié)NCS共氧 化劑的量來(lái)將水解的血清型12F多糖氧化至不同的氧化度(DO)水平。在圖2中示出使用 不同多糖批次和分子量的由不同量的NCS對(duì)DO的影響。通常,0. 5摩爾當(dāng)量至2. 5摩爾當(dāng) 量的NCS用于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)氧化度。通常,氧化反應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)完成,因?yàn)樵?小時(shí)之后沒(méi)有觀(guān) 察到DO的顯著變化。
[0188] 使用TEMP0/NCS氧化的多糖生成并表征多個(gè)血清型12F綴合物。結(jié)果總結(jié)于表1 中。使用其他用TEMPO/NCS體系活化的肺炎球菌血清型也成功地生成了一些代表性綴合 物。生成其他肺炎球菌血清型的操作與用于血清型12F的方法相同。結(jié)果描述于表2至4 中。
[0189] 表1 :肺炎球菌血清型12F_CRM197綴合物
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物的方法,其包括以下步驟: a) 使糖與穩(wěn)定的硝?;衔锖脱趸瘎┓磻?yīng)以產(chǎn)生活化的糖;以及 b) 使所述活化的糖與包含一個(gè)或多個(gè)氨基的載體蛋白反應(yīng)。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述穩(wěn)定的硝?;衔餅榫哂性谘趸瘎┑拇嬖谙?選擇性氧化伯醇以產(chǎn)生醛基而不影響仲羥基的能力的哌啶-N-氧基或P比略燒-N-氧基化合 物。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法,其中所述穩(wěn)定的硝酰基化合物為具有在氧化劑的 存在下選擇性氧化伯醇以產(chǎn)生醛基而不過(guò)度氧化成羧基的能力的哌啶-N-氧基或吡咯 燒 -N-氧基化合物。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述穩(wěn)定的硝?;衔餅榫哂性谘趸瘎┑拇嬖谙?選擇性氧化伯醇以產(chǎn)生醛基而不影響仲羥基的能力的帶有TEMPO或PROXYL (2, 2, 5, 5-四甲 基-I- P比略烷氧基)部分的分子。
5. 如權(quán)利要求1或4所述的方法,其中所述穩(wěn)定的硝?;衔餅榫哂性谘趸?劑的存在下選擇性氧化伯醇以產(chǎn)生醛基而不過(guò)度氧化成羧基的能力的帶有TEMPO或 PROXYL(2, 2, 5, 5-四甲基-1-吡咯烷氧基)部分的分子。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述硝?;衔镞x自TEMP0、2, 2, 6, 6-四甲 基-4-(甲基磺酰氧基)-1-哌啶氧基、4-膦酰氧基-TEMP0、4-氧代-TEMP0、4-甲氧 基-TEMPO、4-異硫氰酸基-TEMPO、4- (2-碘乙酰氨基)-TEMPO自由基、4-羥基-TEMPO、 4- 氰基-TEMPO、4-羧基-TEMPO、4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO、4-氨基-TEMPO、4-乙酰氨 基-2, 2, 6, 6-四甲基哌啶1-氧基。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述硝?;衔镞x自3 0 -D0XYL-5 a -膽甾烷、 5- D0XYL-硬脂酸、16-D0XYL-硬脂酸、5-D0XYL-硬脂酸甲酯、3-(氨基甲基)-PR0XYU3-氨 甲酰基-PR0XYL、3-氨甲酰基-2, 2, 5, 5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧基、3-羧基-PR0XYL、3-氰 基-PROXYL。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述硝?;衔餅門(mén)EMPO或其衍生物。
9. 如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述氧化劑為具有在硝?;衔锏?存在選擇性氧化伯醇以產(chǎn)生醛基的能力的帶有N-鹵代部分的分子。
10. 如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述氧化劑選自N-氯代琥珀酰 亞胺、N-溴代瑭I自酰亞胺、N-碘代瑭I自酰亞胺、二氯異氛尿酸、1,3, 5-二氯-1,3, 5-二 嗪-2, 4, 6-三酮、二溴異氰尿酸、1,3, 5-三溴-1,3, 5-三嗪-2, 4, 6-三酮、二碘異氰尿酸以 及1,3, 5-三碘-1,3, 5-三嗪-2, 4, 6-三酮。
11. 如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述氧化劑為N-氯代琥珀酰亞胺。
12. 如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述反應(yīng)的步驟a)在水性溶劑中進(jìn) 行。
13. 如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述反應(yīng)的步驟a)在非質(zhì)子溶劑中 進(jìn)行。
14. 如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述反應(yīng)的步驟a)在DMSO(二甲亞 砜)溶劑中進(jìn)行。
15. 如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述糖與0. 1摩爾當(dāng)量至10摩爾當(dāng) 量的氧化劑反應(yīng)。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法,其中所述糖與0. 5摩爾當(dāng)量至1. 5摩爾當(dāng)量的氧化劑 反應(yīng)。
17. 如權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述穩(wěn)定的硝酰基化合物以催化量 存在。
18. 如權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述糖與少于0. 3摩爾當(dāng)量的穩(wěn)定 的硝?;衔锓磻?yīng)。
19. 制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物的方法,其包括以下步驟: a) 使糖與2, 2, 6, 6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亞胺(NCS)在水性 溶劑中反應(yīng)以產(chǎn)生活化的糖;以及 b) 使所述活化的糖與包含一個(gè)或多個(gè)氨基的載體蛋白反應(yīng)。
20. 如權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述活化的糖的氧化度為3至40。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法,其中所述活化的糖的氧化度為6至14。
22. 如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述糖為細(xì)菌莢膜多糖。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法,其中所述莢膜多糖源自肺炎鏈球菌(S. pneumoniae)。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法,其中所述莢膜多糖選自Pn-血清型3、Pn-血清型10A、 Pn-血清型12F和Pn-血清型33F莢膜多糖。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法,其中所述莢膜多糖為Pn-血清型12F莢膜多糖。
26. 如權(quán)利要求22所述的方法,其中所述莢膜多糖源自腦膜炎奈瑟氏球菌 (N. meningitidis) 〇
27. 如權(quán)利要求26所述的方法,其中所述莢膜多糖選自腦膜炎球菌(Mn)-血清型A、C、 W135和Y莢膜多糖。
28. 如權(quán)利要求26所述的方法,其中所述莢膜多糖為腦膜炎球菌(Mn)-血清型X莢膜 多糖。
29. 如權(quán)利要求22所述的方法,其中所述莢膜多糖源自B組鏈球菌(Group B Streptococcus, GBS)〇
30. 如權(quán)利要求29所述的方法,其中所述莢膜多糖選自GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV、 V、VI、VII 和 VIII0
31. 如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述載體蛋白是來(lái)自破傷風(fēng)、白喉、 百日咳、假單胞菌屬(Pseudomonas)、大腸桿菌(E.coli)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)或 鏈球菌屬(Streptococcus)的毒素。
32. 如權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述載體蛋白為CRM 197。
33. 如權(quán)利要求1至32中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述糖是合成得到的。
34. 如權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)所述的方法,其中在步驟a)之前,將所述糖按尺寸分 級(jí)。
35. 如權(quán)利要求34所述的方法,其中將所述糖水解或機(jī)械地按尺寸分級(jí)。
36. 如權(quán)利要求34所述的方法,將所述糖水解或通過(guò)加壓均化而機(jī)械地按尺寸分級(jí)以 實(shí)現(xiàn)50kDa至500kDa的分子量。
37. 如權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)所述的方法,其中在步驟a)之前,將所述糖水解至 IOOkDa至400kDa的分子量。
38. 如權(quán)利要求37所述的方法,其中將所述糖水解至150kDa至350kDa的分子量。
39. 如權(quán)利要求1至38中任一項(xiàng)所述的方法,其還包括在步驟b)之前純化所述活化的 多糖的步驟。
40. 如權(quán)利要求1至39中任一項(xiàng)所述的方法,其還包括在步驟b)之后添加還原劑的步 驟。
41. 如權(quán)利要求40所述的方法,其中所述還原劑為NaCNBH 3。
42. 如權(quán)利要求41所述的方法,其還包括在添加NaCNBH 3之后添加NaBH 4的步驟。
43. 如權(quán)利要求42所述的方法,其還包括在添加NaBH 4之后的純化步驟。
44. 糖綴合物,其通過(guò)權(quán)利要求1至43中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生。
45. 糖綴合物,其可通過(guò)權(quán)利要求1至43中任一項(xiàng)所述的方法獲得。
46. 如權(quán)利要求44或45所述的糖綴合物,其具有約50kDa至約20, OOOkDa的分子量。
47. 如權(quán)利要求44或45所述的糖綴合物,其具有約500kDa至約5, OOOkDa的分子量。
48. 如權(quán)利要求44或45所述的糖綴合物,其具有約1,OOOkDa至約3, OOOkDa的分子 量。
49. 如權(quán)利要求44或45所述的糖綴合物,其具有約600kDa至約2800kDa ;約700kDa至 約 2700kDa ;約 1000 kDa 至約 2000kDa ;約 1800kDa 至約 2500kDa ;約 IlOOkDa 至約 2200kDa ; 約 1900kDa 至約 2700kDa ;約 1200kDa 至約 2400kDa ;約 1700kDa 至約 2600kDa ;約 1300kDa 至約2600kDa ;或約1600kDa至約3000kDa的分子量。
50. 如權(quán)利要求44至49中任一項(xiàng)所述的糖綴合物,其包含細(xì)菌莢膜多糖,其中所述莢 膜多糖具有IOkDa至2, OOOkDa的分子量。
51. 如權(quán)利要求44至49中任一項(xiàng)所述的糖綴合物,其包含細(xì)菌莢膜多糖,其中所述莢 膜多糖具有50kDa至1,OOOkDa的分子量。
52. 如權(quán)利要求44至51中任一項(xiàng)所述的糖綴合物,其包含相對(duì)于總多糖少于約30% 的游離糖。
53. 如權(quán)利要求44至51中任一項(xiàng)所述的糖綴合物,其包含相對(duì)于總多糖少于約20%、 15%、10%或5%的游離多糖。
54. 如權(quán)利要求44至53中任一項(xiàng)所述的糖綴合物,所述載體蛋白為CRM 197。
55. 如權(quán)利要求44至54中任一項(xiàng)所述的糖綴合物,其中所述糖:載體蛋白的比率(w/ w)為 0? 2 至 4。
56. 如權(quán)利要求44至54中任一項(xiàng)所述的糖綴合物,其中所述糖:載體蛋白的比率(w/ w)為 L 1 至 L 7。
57. 如權(quán)利要求44至56中任一項(xiàng)所述的糖綴合物,其中對(duì)于所述多糖的每100個(gè)糖重 復(fù)單元,在所述載體蛋白與所述多糖之間存在至少一個(gè)共價(jià)鍵。
58. 如權(quán)利要求57所述的糖綴合物,其中在所述多糖的每4個(gè)糖重復(fù)單元中所述載體 蛋白與所述多糖之間的共價(jià)鍵出現(xiàn)至少一次。
59. 如權(quán)利要求57所述的糖綴合物,其中在所述多糖的每10個(gè)糖重復(fù)單元中所述載體 蛋白與所述多糖之間的共價(jià)鍵出現(xiàn)至少一次。
60. 如權(quán)利要求57所述的糖綴合物,其中在所述多糖的每15個(gè)糖重復(fù)單元中所述載體 蛋白與所述多糖之間的共價(jià)鍵出現(xiàn)至少一次。
61. 如權(quán)利要求57所述的糖綴合物,其中在所述多糖的每20個(gè)糖重復(fù)單元中所述載體 蛋白與所述多糖之間的共價(jià)鍵出現(xiàn)至少一次。
62. 如權(quán)利要求57所述的糖綴合物,其中對(duì)于每5至10個(gè)糖重復(fù)單元,所述綴合物包 含至少一個(gè)在所述載體蛋白與所述糖之間的共價(jià)鍵。
63. 如權(quán)利要求57所述的糖綴合物,其中對(duì)于每2至7個(gè)糖重復(fù)單元;每3至8個(gè)糖 重復(fù)單元;每4至9個(gè)糖重復(fù)單元;每6至11個(gè)糖重復(fù)單元;每7至12個(gè)糖重復(fù)單元;每 8至13個(gè)糖重復(fù)單元;每9至14個(gè)糖重復(fù)單元;每10至15個(gè)糖重復(fù)單元;每2至6個(gè)糖 重復(fù)單元;每3至7個(gè)糖重復(fù)單元;每4至8個(gè)糖重復(fù)單元;每6至10個(gè)糖重復(fù)單元;每7 至11個(gè)糖重復(fù)單元;每8至12個(gè)糖重復(fù)單元;每9至13個(gè)糖重復(fù)單元;每10至14個(gè)糖 重復(fù)單元;每10至20個(gè)糖重復(fù)單元;或每4至25個(gè)糖重復(fù)單元,所述綴合物包含至少一個(gè) 在所述載體蛋白與所述糖之間的共價(jià)鍵。
64. 免疫原性組合物,其包含權(quán)利要求44至63中任一項(xiàng)所述的糖綴合物以及藥學(xué)上可 接受的賦形劑、載體或稀釋劑。
65. 如權(quán)利要求64所述的免疫原性組合物,其還包含其它抗原。
66. 如權(quán)利要求65所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括蛋白抗原或源自肺 炎鏈球菌的莢膜多糖的糖綴合物。
67. 如權(quán)利要求66所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合 物,所述莢膜多糖選自 Pn-血清型 1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、14、15B、18C、19A、19F、22F* 23F莢膜多糖。
68. 如權(quán)利要求65所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括蛋白抗原或源自腦 膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖的糖綴合物。
69. 如權(quán)利要求68所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合 物,所述莢膜多糖選自血清型A、C、W135和Y莢膜多糖。
70. 如權(quán)利要求65所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合 物,所述莢膜多糖源自B組鏈球菌(GBS)。
71. 如權(quán)利要求70所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合 物,所述莢膜多糖選自GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII。
72. 如權(quán)利要求64至71中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其還包含佐劑。
73. 如權(quán)利要求72所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑為鋁系佐劑。
74. 如權(quán)利要求73所述的免疫原性組合物,其中所述鋁系佐劑選自磷酸鋁、硫酸鋁和 氫氧化鋁。
75. 免疫原性組合物,其包含與載體蛋白綴合的Pn-血清型12F,其中從其制備時(shí)起120 天之后,所述組合物中游離Pn-血清型12F多糖的量少于35%。
76. 如權(quán)利要求75所述的免疫原性組合物,其中從其制備時(shí)起120天之后,游離Pn-血 清型12F多糖的量少于30%。
77. 如權(quán)利要求75或76所述的免疫原性組合物,其中所述載體蛋白是來(lái)自破傷風(fēng)、白 喉、百日咳、假單胞菌屬、大腸桿菌、葡萄球菌屬或鏈球菌屬的毒素。
78. 如權(quán)利要求75或76所述的免疫原性組合物,其中所述載體蛋白為CRM 197。
79. 如權(quán)利要求75至78中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其還包含藥學(xué)上可接受的賦 形劑、載體或稀釋劑。
80. 如權(quán)利要求75至79中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其還包含其它抗原。
81. 如權(quán)利要求80所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括蛋白抗原或源自肺 炎鏈球菌的莢膜多糖的糖綴合物。
82. 如權(quán)利要求81所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合 物,所述莢膜多糖選自 Pn-血清型 1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、11A、14、15B、18C、19A、19F、22F* 23F莢膜多糖。
83. 如權(quán)利要求82所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括蛋白抗原或源自腦 膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖的糖綴合物。
84. 如權(quán)利要求83所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合 物,所述莢膜多糖選自血清型A、C、W135和Y莢膜多糖。
85. 如權(quán)利要求83所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括血清型X莢膜多糖 的糖綴合物。
86. 如權(quán)利要求80所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合 物,所述莢膜多糖源自B組鏈球菌(GBS)。
87. 如權(quán)利要求86所述的免疫原性組合物,其中所述其它抗原包括莢膜多糖的糖綴合 物,所述莢膜多糖選自GBS血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII。
88. 如權(quán)利要求75至87中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其還包含佐劑。
89. 如權(quán)利要求88所述的免疫原性組合物,其中所述佐劑為鋁系佐劑。
90. 如權(quán)利要求89所述的免疫原性組合物,其中所述鋁系佐劑選自磷酸鋁、硫酸鋁和 氫氧化鋁。
91. 預(yù)防、治療或改善個(gè)體的細(xì)菌感染、疾病或病癥的方法,其包括向所述個(gè)體給藥免 疫有效量的權(quán)利要求64至90中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物。
92. 如權(quán)利要求91所述的方法,其中所述感染、疾病或病癥與肺炎鏈球菌 (S. pneumoniae)相關(guān)。
93. 如權(quán)利要求91所述的方法,其中所述感染、疾病或病癥與腦膜炎奈瑟氏球菌相關(guān)。
94. 如權(quán)利要求91所述的方法,其中所述感染、疾病或病癥與B組鏈球菌相關(guān)。
95. 在個(gè)體中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法,其包括向所述個(gè)體給藥免疫有效量的權(quán)利 要求64至90中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物。
96. 如權(quán)利要求64至90中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其用作藥物。
97. 如權(quán)利要求44至63中任一項(xiàng)所述的糖綴合物,其用作藥物。
98. 如權(quán)利要求64至90中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其用作疫苗。
99. 如權(quán)利要求64至90中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其用于預(yù)防、治療或改善個(gè) 體的細(xì)菌感染、疾病或病癥的方法。
100. 如權(quán)利要求64至90中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物,其用于在個(gè)體中誘導(dǎo)保護(hù) 性免疫應(yīng)答的方法。
【專(zhuān)利摘要】概括而言,本發(fā)明涉及通過(guò)使用穩(wěn)定的硝酰基相關(guān)的試劑/氧化劑作為氧化物質(zhì)來(lái)制備包含與載體蛋白綴合的糖的糖綴合物的方法、包含此類(lèi)糖綴合物的免疫原性組合物以及使用此類(lèi)糖綴合物和免疫原性組合物的方法。
【IPC分類(lèi)】C07K1-107, C07H3-06, A61K39-09, A61K47-48
【公開(kāi)號(hào)】CN104870463
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380066823
【發(fā)明人】M·韓, R·K·凱因森, J-H·金, A·K·普拉薩德
【申請(qǐng)人】輝瑞公司
【公開(kāi)日】2015年8月26日
【申請(qǐng)日】2013年12月13日
【公告號(hào)】CA2893343A1, WO2014097099A2, WO2014097099A3