一種軍團(tuán)菌毒力基因分型檢測試劑盒及其使用方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種軍團(tuán)菌毒力基因分型檢測試劑盒，具體為一種不僅能檢測臨床和 環(huán)境水標(biāo)本中軍團(tuán)菌，而且可以對軍團(tuán)菌中的10個毒力基因進(jìn)一步作出基因分型的快速 檢測試劑盒；本發(fā)明還涉及其使用方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，軍團(tuán)菌檢測試劑盒主要分為兩大類：一是利用抗原抗體反應(yīng)檢測軍團(tuán)菌特 異性抗體或抗原，此類試劑盒包括軍團(tuán)菌ELISA法試劑盒以及嗜肺軍團(tuán)菌尿抗原檢測試劑 盒。因為軍團(tuán)菌相關(guān)抗原或抗體在軍團(tuán)菌感染病人體內(nèi)出現(xiàn)較晚，一般需要一周及以上的 時間才能檢測到，而且只能檢測嗜肺軍團(tuán)菌，并有一定的交叉反應(yīng)，所以該類型的試劑盒具 有一定的局限性；第二類是利用分子生物學(xué)方法檢測軍團(tuán)菌，如熒光定量PCR和PCR酶切 分型檢測軍團(tuán)菌或嗜肺軍團(tuán)菌種試劑盒，該試劑盒可用以檢測嗜肺軍團(tuán)菌和非嗜肺軍團(tuán)菌 種，但不能對軍團(tuán)菌毒力基因進(jìn)行分型檢測。雖然臨床上80%以上的軍團(tuán)菌感染是由嗜肺 軍團(tuán)菌引起的，水環(huán)境也廣泛存在嗜肺軍團(tuán)菌，但是非嗜肺軍團(tuán)菌也具有較為廣泛的存在 性和一定的感染力，目前已知至少有24種軍團(tuán)菌與人類疾病相關(guān)。因此，一種既能檢測軍 團(tuán)菌種又能對軍團(tuán)菌毒力基因進(jìn)行分型檢測的試劑盒是很必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術(shù)中軍團(tuán)菌檢測試劑盒存在的不足，本發(fā)明提供了一種軍團(tuán)菌毒力基 因分型檢測試劑盒，該試劑盒不僅能夠檢測臨床和環(huán)境水標(biāo)本中的軍團(tuán)菌，而且能夠快速 的對軍團(tuán)菌中存在的毒力基因進(jìn)一步分型檢測；本發(fā)明還提供該試劑盒的使用方法和應(yīng) 用。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 本發(fā)明提供一種軍團(tuán)菌毒力基因分型檢測試劑盒，所述試劑盒包括細(xì)菌基因組DNA提 取液、PCR反應(yīng)混合液和PCR上下游引物混合液；其中，所述PCR上下游引物混合液為10對 引物，具體為： (1) iraA-F :5' -CCTGTAGCGCAACAACAACT-3' ； iraA-R:5' -CCAGGTGCCCTCTATTCCAA-3' ； (2) iraB-F :5' -CGCATCCAGTATGGTTTCTC-3' ； iraB-R:5' -AACGTTTCGCAAAATTCAAG-3' ； (3) IvrA-F :5' -CAAAGAACAACGCACAAGCA-3' ； IvrA-R :5' -GCAAGCCAATTTGCTGGGT-3' ； (4) IvrB-F :5' -TAAAACGATGGAGCCAATC-3' ； IvrB-R :5' -ACCTGCAATGATGATGCAAG-3' ； (5) IvhD-F :5' -CAAAATTCAACGCCTGACCG-3' ； IvhD-R :5' -AGGCCAGCCAATCATCAAATC-3' ； (6) cpxR-F :5' -AAAATCCCAACTCCCAAAC-3' ； cpxR-R:5' -CGATACTGCGGTCATAAGC-3' ； (7) cpxA-F :5' -ACAACCAGCTCGAGAGGA-3' ； cpxA-R:5' -GCCATCACTTGGGAGTTC-3' ； (8) dotA-F :5' -TTGGTGCAGCCGATAAAAT-3' ； dotA-R:5' -ACCCCACAAGGTGGACTCTT-3' ； (9) icmC-F :5' -ATGGAGAAGCCAGGACAA-3' ； icmC-R:5' -ACCCGGATAATCATCACCA-3' ； (10) icmD-F :5' -GGCTAGTAAGCGCAGCTTG-3' ； icmD-R :5' -CCCAATCCAGCCAAGTAAG-3'。
[0005] 本發(fā)明根據(jù)嗜肺軍團(tuán)菌特有的65 kb毒力基因及其他有關(guān)毒力基因，設(shè)計了 10對 檢測毒力基因的特異性引物，制作成10種不同的PCR引物混合液，還設(shè)計了細(xì)菌基因組DNA 的提取和PCR反應(yīng)體系混合液，用于檢測軍團(tuán)菌毒力基因。
[0006] 優(yōu)選地，所述細(xì)菌基因組DNA提取液的典型的配方為：Chelex 100 resin 5%; Tris-HCl 10 mM，pH8.3;乙二胺四乙酸二鈉 0.1 mM;疊氮鈉 0.1 %;蛋白酶 K 200 μg/ml。
[0007] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽性對照液，所述陽性對照液包含軍團(tuán)菌基因組 DNA 和特異引物，所述特異引物為：Leg386F: 5' -ACGGTTGATAGGTTAAGAGC-3' ；Leg386R: 5' -CCAACAGCTAGTTGACATCG-3'。所述軍團(tuán)菌基因組DNA提取自嗜肺軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC33152,序列在NCBI基因庫編號為NC_002942. 5 ;引物擴增序列為軍團(tuán)菌屬16S riWJ基 因一段保守序列，具體序列如下： AGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAG TTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGG AATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGCCTAATACT GACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCAACTA GCTGTTGG。
[0008] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述試劑盒的使用方法，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取液 提取待測樣品中的細(xì)菌基因組DNA ;以細(xì)菌基因組DNA為模板，用對應(yīng)的PCR上下游引物混 合液進(jìn)行PCR擴增，同時對陽性對照和陰性對照進(jìn)行PCR擴增，將所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂 糖凝膠電泳，若出現(xiàn)條帶，則說明標(biāo)本中含有與PCR上下游引物混合液對應(yīng)的軍團(tuán)菌毒力 基因；反之，則說明標(biāo)本中不含與PCR上下游引物混合液對應(yīng)的軍團(tuán)菌毒力基因。
[0009] 優(yōu)選地，所述 PCR 擴增條件為：94 °C 3 min, 94 °C 30 s, 57 °C 30s, 72 °C 20 s，35個循環(huán)，72 °C 5 min, 4°C貯存。本發(fā)明所設(shè)計的11對引物(包括陽性對照液使用的 特異引物）均能夠在此條件下完成擴增。
[0010] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述的試劑盒在檢測和分型軍團(tuán)菌毒力基因中的應(yīng) 用。
[0011] 優(yōu)選地，所述軍團(tuán)菌毒力基因為：ira兒 irai?，//-以，/κτΖ?，/fAA c/λ??， ic/nCy icmDo
[0012] 本發(fā)明的第四個目的是提供PCR擴增引物在檢測軍團(tuán)菌毒力基因中的應(yīng)用，所述 PCR擴增引物為： (1) iraA-F :5' -CCTGTAGCGCAACAACAACT-3' ； iraA-R:5' -CCAGGTGCCCTCTATTCCAA-3' ； (2) iraB-F :5' -CGCATCCAGTATGGTTTCTC-3' ； iraB-R:5' -AACGTTTCGCAAAATTCAAG-3' ； (3) IvrA-F :5' -CAAAGAACAACGCACAAGCT-3' ； IvrA-R :5' -GCAAGCCAATTTGCTGGGT-3' ； (4) IvrB-F :5' -TAAAACGATGGAGCCAATC-3' ； IvrB-R :5' -ACCTGCAATGATGATGCAAG-3' (5) IvhD-F :5' -CAAAATTCAACGCCTGACCG-3' ； IvhD-R :5' -AGGCCAGCCAATCATCAAATC-3' ； (6) cpxR-F :5' -AAAATCCCAACTCCCAAAC-3' ； cpxR-R:5' -CGATACTGCGGTCATAAGC-3' ； (7) cpxA-F :5' -ACAACCAGCTCGAGAGGA-3' ； cpxA-R:5' -GCCATCACTTGGGAGTTC-3' ； (8) dotA-F :5' -TTGGTGCAGCCGATAAAAT-3' ； dotA-R:5' -ACCCCACAAGGTGGACTCTT-3' ； (9) icmC-F :5' -ATGGAGAAGCCAGGACAA-3' ； icmC-R:5' -ACCCGGATAATCATCACCA-3' ； (10) icmD-F :5' -GGCTAGTAAGCGCAGCTTG-3' ； icmD-R :5' -CCCAATCCAGCCAAGTAAG-3'。
[0013] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種軍團(tuán)菌專用的痰消化液，所述痰消化液由以下組 分組成：每100g水中含有二硫蘇糖醇2.0 g，乙二胺四乙酸0.894 g，氯化鉀0.4 g，磷酸氫 二鉀3.6 g，磷酸二氫鉀0.4 g。
[0014] 本發(fā)明的試劑盒不僅可用于臨床標(biāo)本如痰液、支氣管灌洗液中軍團(tuán)菌的毒力基因 檢測，也可用于環(huán)境水標(biāo)本(如江河湖泊水、空調(diào)冷凝水）中軍團(tuán)菌毒力基因檢測，具有快 速，簡便，易于使用的優(yōu)點。同時本試劑盒還可以對軍團(tuán)菌中10個毒力基因進(jìn)行分型，即通 過本試劑盒的檢測，可以獲知臨床標(biāo)本與水環(huán)境標(biāo)本中軍團(tuán)菌的毒力基因分布形式。最低 檢測限度達(dá)1-10個軍團(tuán)菌DNA，特異性在95%以上。
[0015] 本試劑盒整個檢測過程只需要4 h，較傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法（3-10天）節(jié)省了大量時 間。同時，減少了核酸產(chǎn)物純化步驟，使試驗方法更為簡便。
【附圖說明】
[0016] 附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為軍團(tuán)菌10個毒力基因凝膠電泳圖；其中，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)；從下到上分別為：100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp。1-10 分別為各個毒力基因（ira兒 ira漢 /κτΖ?，c/λ??，PC 為陽性對照，NC 為陰性對照。
【具體實施方式】
[0017] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市 售。
[0018] 實施例1 一、本發(fā)明的軍團(tuán)菌毒力基因分型快速檢測試劑盒 本發(fā)明的試劑盒包括細(xì)菌基因組DNA提取液，PCR反應(yīng)體系混合液和毒力基因引物混 合液以及其他一些必要試劑，以上液體分別