置于容器內(nèi)，進(jìn)行PCR試驗(yàn)，用以對軍團(tuán)菌毒力 基因進(jìn)行分型檢測。具體組成參見表1。經(jīng)試驗(yàn)，本試劑盒在_20°C干燥的條件下，保存期 為半年。每次使用前，需在4°C下解凍各試劑。
[0019] 表1軍團(tuán)菌毒力基因分型檢測試劑盒的組成
各組分的具體組成或配制方法如下： 1、細(xì)菌基因組DNA提取液組成成份參見表2。
[0020] 表2 DNA提取液組成成份
其中，Chelex 100 resin購買自bio-rad公司，它是一種由苯乙稀，二乙稀苯組成的化 學(xué)螯合樹脂，含有成堆的亞氨基乙二酸鹽離子。在低離子強(qiáng)度，堿性及煮沸條件下，可以使 細(xì)胞膜或壁破裂，并使蛋白變性，通過離心去除chelex顆粒，即可使其結(jié)合物質(zhì)與DNA分 離。EDTA-Na2在整個(gè)溶液中提供一定的離子強(qiáng)度，而蛋白酶K的存在使細(xì)菌細(xì)胞壁更容易 破裂，并消化細(xì)菌中蛋白，使DNA更易分離。Tris-HCl提供緩沖系統(tǒng)，疊氮鈉防止溶液變性。
[0021] 2、PCR反應(yīng)混合液由以下組分組成：2XPCR反應(yīng)混合液（2XTaq PCR Master Mix, 含 0· I U Taq Polymerase/μ 1，500 μ M dNTP ,20 mM Tris-HCl (ρΗ8· 3)，100 mM KC1，3 mM MgCl2, ) 12. 5 yL；ddH20 5.5 yL〇
[0022] 3、PCR上下游引物混合液共計(jì)10管，分別編號(hào)1-10,引物濃度為10 ymol/L。每 管按順序?qū)?yīng)檢測一種軍團(tuán)菌毒力基因，分別為兒irai?; //-以，c/λ??， ?/ο?兒沒P 因。檢測時(shí)每管反應(yīng)體系分別加入其中一種引物。
[0023] PCR上下游引物設(shè)計(jì)原理為： 根據(jù)Genebank數(shù)據(jù)庫報(bào)告軍團(tuán)菌毒力基因組序列，設(shè)計(jì)10對4組檢測軍團(tuán)菌毒力基 因引物：iraAB 2 個(gè)（ira兒 irai?);65kb PAI 3 個(gè)（7κτ兒 /ktZ?, _/fAZ^);cpxRA 2 個(gè)（c/λ??， c/?x4);dot/icm 3個(gè)奶。這些毒力基因與軍團(tuán)菌的致病性密切相關(guān)。毒 力基因的作用是增加了細(xì)菌的適應(yīng)性，是細(xì)菌演變及其致病性的關(guān)鍵。嗜肺軍團(tuán)菌 毒力基因是嗜肺軍團(tuán)菌鐵（Fe)的攝取以及細(xì)胞內(nèi)感染和毒力所必須的。嗜肺軍團(tuán)菌65kb PAI毒力基因組（lvrA、lvrA、IvhD)是其在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)生長所必須。CpxRA毒力基因組是 反應(yīng)調(diào)節(jié)器和組氨酸激酶傳感器，主要作用是調(diào)節(jié)菌毛形成，黏附以及生物膜的形成，是其 侵入宿主細(xì)胞所必須。dot/icm (細(xì)胞器運(yùn)輸缺陷/細(xì)胞內(nèi)繁殖基因組)是其在人體巨噬細(xì) 胞內(nèi)生長所必須，屬于IV型分泌系統(tǒng)。此外，dot/icm基因編碼具有黏附和侵襲作用。而 且在細(xì)胞毒和宿主細(xì)胞小孔形成方面起作用。
[0024] 引物的核苷酸序列和擴(kuò)增的靶基因參見表3。
[0025] 表3軍團(tuán)菌10對引物對應(yīng)的引物序列和靶基因片段大小
上述引物所擴(kuò)增的核苷酸序列分別為： iraA-F 與 iraA-R : CCTGTAGCGCAACAACAACTGGCCAACTTCATTGCTCAGGATACTATTTTAAGCCGAGTTGTTGGTCACTA CTATAAATCCATAGTTAAAAATACGACTGTTGCTGCAAATCTCGATGAACTCTTGCTGGCATTTAAACAGCATCAA TTTAATATTTTGGATCACCAACGTATTGAAATACCCATTACCCTTAATAACATTGATGAATTGGCACTGTTTGGAAT AGAGGGCACCTGG ； iraB-F 與 iraB-R : CGCATCCAGTATGGTTTCTCATATTTATTCTGATGATGCCATTAAAGCCAAATCCGCTATGACTTATTACT ATATGGCCATTAATGTTGGAGCTCTGCTGGCCACCATGATCGCGCCAGTTCTCCTGGAAAGTCGTTATGGCCCACT TTCAGTACTCACCTTAACCTTTATTGGCAAATCGATTGCTGCCTTGAATTTTGCGAAACGTT ； IvrA-F 與 IvrA-R : Caaagaacaacgcacaagctgtatttgaagagcttaaacctaatgctgaattgtgccactccatcatcaac gcactgacagcccaaattaatcatcgtgacaccatgaaactacaaggcacttgggtgccaccttggaaatacccag caaattggcttgc； IvrB-F 與 IvrB-R : Taaaacgatggagccaatcccttggcaacctctatttaatagcagtttgcactttgctgccaacgctgtca catgcccaatcaatagaaagcatcatcaacagaaccatcaattaccttcagggtgggcttgccagaaccgtgggcg ttttttgcatcatcattgcagg ； IvhD-F 與 IvhD-R : Caaaattcaacgcctgaccgatattcagcgcatagcccatattttaatgccagacaataaaaaatccgacc ccatttggcagcaagcctcacgtaagttatttaaagtggctgtgttgtacctgctggacacacctgaaaggcccac cacgcttggcgaaataaatcgcttggtcaaacaggctggatttgatgattggctggctt ； cpxR-F 與 cpxR-R: AAAAATCCCAACTCCCAAACCTATTATTGAACAACATAATATCATTGTGGATTGCTCCAAACGCCACGTGA CTATGGGAGGAAAATTCCTTGAATTAACCAATGCGGAATTTAATATTTTGGAGATGTTAATCAAATCACCAGGGCA AGCATTTTCCAAAGAGGAACTCACCGAATATGCTCTGGGAAGAAAATACACTGCTTATGACCGCAGTATCG ； cpxA-F 與 cpxA-R : ACAACCAGCTCGAGAGGAAATGTTCATGGACAGCTATGCCAATGCAGCTGTCGCAACCTATGAGTCAGGCC AACAATCAGCACTTTTGAAATGGCTTGATAAAATAGGCCTTTCTCGTCATATGACACTGTATTTACTAACCAGCAC CGGCGAAATCATTGGCGCACAGAAACCACCTGACGCCGTAAAAAAAATTTCAGAAAATTTAATAAATGATGAACTCC CAAGTGATGGC ； dotA-F 與 dotA-R : GTGCAGCCGATAAAATATGGGAAGCCGCCTTGAGTTATCTCAACCGGGGTGGCGTGATAATACAGGCTCAG GCCGATCCAACCAAGAGCTTGCAAGCAGCCGGATCTTCGTCTTCCGGTGTTGCAAAGGGAGCGTTAACTATATTGG GTGGCCAAATCTGCATGTTGGGTTTACAAAAACAATTACAAGCACAAAGAGATCTTTATTTGAGTCAAAGTAAGAGT CCACCTTGGTGGGGT ； icmC-F 與 icmC-R : ATGGAGAAGCCAGGACAATGATGTCGAGTAATACGAGTATCAAAGAGCCGGTGATGTATTTGATGGTAGGT GCATTACTTATCTATTTCCCGTCATTGGTTTCCTCCGTACTGCAAACGACTTTTGGTTATAGCAATCCATTAGCCT ACTCAGGAGGTGTGAGTAGTGGAAGCGATACTATTTCAGCCTTATTTGGTAGTGGCAGTCTAGTAGGCAGACCTTTG GTGATGATTATCCGGGT ； icmD-F 與 icmD-R : GGCTAGTAAGCGCAGCTTGTTTGGCTTTATTGACTCTAATTTGTCAGGATGCTGCAGCAGGTGTATCGTTA GGTAAAATGGCATCACAAATTACGGGTTCATTTACAAGTCTTACTAAATTGATTACAGCGGGCTCTTACTTGGCTG GATTGGGo
[0026] 各種毒力島所對應(yīng)的基因功能如下： (iron assimilation)是鐵的攝取、細(xì)胞內(nèi)感染和毒力因子； 從姑/?/是嗜肺軍團(tuán)菌65kb毒力島基因組； 是嗜肺軍團(tuán)菌dot/icm毒力基因正相調(diào)節(jié)劑，是細(xì)胞內(nèi)繁殖和殺傷人巨細(xì) 胞； Ai/im細(xì)胞器運(yùn)輸缺陷/細(xì)胞內(nèi)繁殖基因組。
[0027] 4、陽性對照液：包含軍團(tuán)菌基因組DNA (提取自嗜肺軍團(tuán)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，菌株編號(hào) ATCC33152,全基因組DNA序列在NCBI基因庫上的編號(hào)為NC_002942. 5)，針對軍團(tuán)菌屬 16SrDNA基因保守片段的特異引物，PCR反應(yīng)混合液等成分，具體組成成份參見表4。使用 時(shí)直接取20 μ 1加入5 μ 1雙蒸水，進(jìn)行PCR反應(yīng)，即為陽性對照。特異引物擴(kuò)增序列為 軍團(tuán)菌屬16S riWJ基因一段保守序列，具體序列如下： AGGGTTGATAGGTTAAGAGCTGATTAACTGGACGTTACCCACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAG CAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGTGGTTGATTAAG TTATCTGTGAAATTCCTGGGCTTAACCTGGGACGGTCAGATAATACTGGTTGACTCGAGTATGGGAGAGGGTAGTGG AATTTCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGCCTAATACT GACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCAACTA GCTGTTGG。
[0028] 陰性對照液：包含特異引物，PCR反應(yīng)混合液等成分，但不包含軍團(tuán)菌基因組DNA， 引物終濃度為0.5 μΜ，具體組成成份參見表4。使用時(shí)直接取20 μL加入5 μL雙蒸水， 進(jìn)行PCR反應(yīng)，即為陰性對照。
[0029] 其中，陽性對照液和陰性對照液所使用的特異引物為針對軍團(tuán)菌16s rDNA 保守序列的引物，序列為 Leg386F: 5'-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3' ；Leg386R: 5'-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3' 。
[0030] 表4陽性對照液和陰性對照液的組成成分<