br>二、應(yīng)用本發(fā)明的軍團菌毒力基因分型快速檢測試劑盒的具體檢測步驟如下： 1、標本預處理（以痰液處理和環(huán)境水標本處理為例，其他標本可參照處理） A.痰標本處理 1)在1.5 ml離心管中加入0.5 ml軍團菌專用的痰消化液；痰消化液為自制，其具體 組成及原理如下： 其組分的質(zhì)量配比如為二硫蘇糖醇（DTT)2.0 g，乙二胺四乙酸0.894 g，氯化鉀0.4 g， 磷酸氫二鉀3. 6 g，磷酸二氫鉀0. 4 g，水100 g。該痰消化液應(yīng)用DTT，使粘蛋白中的二硫 鍵斷裂，從而降解粘蛋白，使痰液消化。在消化液中添加 EDTA能和堿金屬、稀土元素和過渡 金屬等形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物，避免重金屬鹽類對軍團菌DNA提取的干擾。緩沖系統(tǒng)由 KCl、K2HPCM和KH2PCM等鉀鹽組成，避免較高的Na+離子對軍團菌DNA提取的抑制作用。
[0031] 2)用槍頭或滅菌牙簽從痰標本中吸取或挑取約0. 5 ml痰標本，置于上述痰消化液 中； 3) 充分混勻后，37°C水浴10~15 min ; 4) 13000 rpm離心5分鐘后，棄上清，用0. 5 ml無菌水洗滌2次后離心留沉淀。支氣 管灌洗液等標本直接離心沉淀濃縮。
[0032] B ·水樣處理 1) 將水樣置于50 ml離心管中，10000 rpm離心10 min，棄上清，留底部I ml懸液，轉(zhuǎn) 移至I. 5 ml離心管； 2) 13000 rpm離心5 min，棄上清，留沉淀物。
[0033] 2.標本中細菌基因組DNA的提?。涸谏鲜隽羧〕恋淼碾x心管中加入細菌基因組 DNA提取液100μ1，56 〇C水浴30 min，100°C水浴10 min，離心沉淀，5000 g 5 min，上清液 即為提取到的基因組DNA，供作DNA模版。
[0034] 3. PCR 反應(yīng) 1) 每個標本準備12個PCR管，做10個反應(yīng)體系，每管中分別加入10個不同的上下游 引物混合液2μ1，標記好管的編號1-10。使每對引物在獨立的反應(yīng)體系中進行擴增以檢測 對應(yīng)的毒力基因。陽性對照及陰性對照亦各為一個體系，編號為PC或NC，直接加入5 μ 1雙 蒸水進行反應(yīng)； 2) 在上述10管中分別加入PCR反應(yīng)體系混合液18 μ 1，再加入基因組DNA模板5 μ 1 ; 總反應(yīng)體系25 μ 1 ; 3) 置 PCR 擴增儀，進行 PCR 反應(yīng)，PCR 反應(yīng)條件：94°C 3min，94°C 30s，57°C 30s， 72°C20 s，35 個循環(huán)，72°C 5min, 4°C 貯存。
[0035] 4.瓊脂糖凝膠電泳 反應(yīng)完成后，將產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，取5 μ I PCR產(chǎn)物，I. 5%瓊脂糖凝膠中，電壓 100V，電泳40 min，加入DNA Marker 5μ1，其條帶從小到大分別為100 bp，200 bp，300 bp， 400 bp，500 bp，600 bp〇
[0036] 凝膠成像，若出現(xiàn)毒力基因條帶，則說明標本中檢出了相對應(yīng)的軍團菌毒力基因。 若無電泳條帶出現(xiàn)，則標本中未檢出軍團菌毒力基因，可能標本中不存在軍團菌。若凝膠成 像后，陰性對照出現(xiàn)條帶，或(和）陽性對照未出現(xiàn)電泳條帶，則實驗結(jié)果不可信，可能存在 污染及誤操作。10個毒力基因條帶不一定全部出現(xiàn)，但是檢出的毒力基因越多，說明樣品中 軍團菌致病性相對越強。不同軍團菌毒力基因電泳圖參見圖1。
[0037] 最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可 以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種軍團菌毒力基因分型檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括細菌基因組 DNA提取液、PCR反應(yīng)混合液和PCR上下游引物混合液；其中，所述PCR上下游引物混合液為 10對引物，具體為： (1) iraA-F:5' -CCTGTAGCGCAACAACAACT-3' ； iraA-R:5' -CCAGGTGCCCTCTATTCCAA-3' ； (2) iraB-F:5' -CGCATCCAGTATGGTTTCTC-3' ； iraB-R:5' -AACGTTTCGCAAAATTCAAG-3' ； (3) IvrA-F:5' -CAAAGAACAACGCACAAGCA-3' ； IvrA-R:5' -TCAAGCCAATTTGCTGGGT-3' ； (4) IvrB-F:5' -TAAAACGATGGAGCCAATC-3' ； IvrB-R:5' -ACCTGCAATGATGATGCAAG-3' ； (5) IvhD-F:5' -CAAAATTCAACGCCTGACCG-3' ； IvhD-R:5' -AGGCCAGCCAATCATCAAATC-3' ； (6) cpxR-F:5' -AAAATCCCAACTCCCAAAC-3' ； cpxR-R:5' -CGATACTGCGGTCATAAGC-3' ； (7) cpxA-F:5' -ACAACCAGCTCGAGAGGA-3' ； cpxA-R:5' -GCCATCACTTGGGAGTTC-3' ； (8) dotA-F:5' -TTGGTGCAGCCGATAAAAT-3' ； dotA-R:5' -ACCCCACAAGGTGGACTCTT-3' ； (9) icmC-F:5' -ATGGAGAAGCCAGGACAA-3' ； icmC-R:5' -ACCCGGATAATCATCACCA-3' ； (10) icmD-F:5' -GGCTAGTAAGCGCAGCTTG-3' ； icmD-R:5' -CCCAATCCAGCCAAGTAAG-3'。2. 根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于：所述細菌基因組DNA提取液的配方通 常為：Chelex100resin5% ;Tris_HCl10mmol/L，pH8. 3 ;乙二胺四乙酸二鈉 0?lmmol/L; 疊氮鈉0.I%;蛋白酶K200yg/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括陽性對照 液，所述陽性對照液包含軍團菌基因組DNA和特異引物；所述特異引物為：Leg386F: 5'-AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3' ；Leg386R: 5'-CCAACAGCTAGTTGACATCG-3' 。4. 權(quán)利要求1-3任一所述的試劑盒的使用方法，其特征在于：應(yīng)用細菌基因組DNA提 取液提取待測樣品中的細菌基因組DNA;以細菌基因組DNA為模板，用PCR上下游引物混合 液進行PCR擴增，同時將陽性對照和陰性對照進行PCR擴增，將所得的PCR產(chǎn)物進行瓊脂 糖凝膠電泳，若出現(xiàn)條帶，則說明標本中含有與PCR上下游引物對應(yīng)的軍團菌毒力基因；反 之，則說明標本中不含與PCR上下游引物對應(yīng)的軍團菌毒力基因。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述PCR擴增條件為：94°C3min，94°C 30s, 57°C30s, 72°C20s，35 個循環(huán)，72°C5min, 4°C貯存。6. 權(quán)利要求1-3任一所述的試劑盒在檢測和分型軍團菌毒力基因中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：所述軍團菌毒力基因為：ir^，irai?， IrvA, IvrB, IvhD, cpxR, cpxA, dot A, icmC, icmD〇 8. PCR擴增引物在檢測軍團菌毒力基因中的應(yīng)用，其特征在于：所述PCR擴增引物為： (1) iraA-F:5' -CCTGTAGCGCAACAACAACT-3' ； iraA-R:5' -CCAGGTGCCCTCTATTCCAA-3' ； (2) iraB-F:5' -CGCATCCAGTATGGTTTCTC-3' ； iraB-R:5' -AACGTTTCGCAAAATTCAAG-3' ； (3) IvrA-F:5' -CAAAGAACAACGCACAAGCA-3' ； IvrA-R:5' -TCAAGCCAATTTGCTGGGT-3' ； (4) IvrB-F:5' -TAAAACGATGGAGCCAATC-3' ； IvrB-R:5' -ACCTGCAATGATGATGCAAG-3' ； (5) IvhD-F:5' -CAAAATTCAACGCCTGACCG-3' ； IvhD-R:5' -AGGCCAGCCAATCATCAAATC-3' ； (6) cpxR-F:5' -AAAATCCCAACTCCCAAAC-3' ； cpxR-R:5' -CGATACTGCGGTCATAAGC-3' ； (7) cpxA-F:5' -ACAACCAGCTCGAGAGGA-3' ； cpxA-R:5' -GCCATCACTTGGGAGTTC-3' ； (8) dotA-F:5' -TTGGTGCAGCCGATAAAAT-3' ； dotA-R:5' -ACCCCACAAGGTGGACTCTT-3' ； (9)icmC-F:5' -ATGGAGAAGCCAGGACAA-3'； icmC-R:5' -ACCCGGATAATCATCACCA-3' ； (10) icmD-F:5' -GGCTAGTAAGCGCAGCTTG-3' ； icmD-R:5' -CCCAATCCAGCCAAGTAAG-3'。9. 一種軍團菌專用的痰消化液，其特征在于：所述痰消化液由以下組分組成：每100g 水中含有二硫蘇糖醇2.0g，乙二胺四乙酸0.894g，氯化鉀0.4g，磷酸氫二鉀3.6g，磷酸 二氫鉀〇? 4g。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種軍團菌毒力基因分型檢測試劑盒，包括細菌基因組DNA提取液、PCR反應(yīng)混合液和PCR上下游引物混合液。本發(fā)明還提供其使用方法和應(yīng)用。本發(fā)明的試劑盒不僅可用于臨床標本如痰液、支氣管灌洗液中軍團菌的毒力基因檢測，也可用于環(huán)境水標本中軍團菌毒力基因檢測，具有快速，簡便，易于使用的優(yōu)點。本試劑盒還可以對軍團菌中10個毒力基因進行分型，即通過本試劑盒的檢測，可以獲知臨床標本與水環(huán)境標本中軍團菌的毒力基因分布形式。最低檢測限度達1-10個軍團菌DNA，特異性在95%以上。本試劑盒整個檢測過程只需要4h，較傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法（3-10天）節(jié)省了大量時間。同時，減少了核酸產(chǎn)物純化步驟，使試驗方法更為簡便。
【IPC分類】C12Q1/68, C12R1/01, C12N15/11, C12Q1/04
【公開號】CN104928362
【申請?zhí)枴緾N201510157302
【發(fā)明人】朱慶義, 詹曉勇, 胡朝暉
【申請人】廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年4月3日