錄號ABK75684.1, SEQ ID NO: 5)、馬賽分枝桿菌（見 Genbank登錄號EIV11143.1, SEQ ID N0:6)或 Segniliparus rotundus (見Genbank登錄號 ADG98140. 1，SEQ ID N0:7)獲得。在一些實施方案中，來自于灰色鏈霉菌GriC和GriD的基 因產(chǎn)物可以用于代替羧酸還原酶和磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶。見圖3。
[0130] 使用7-氨基庚酸、7-羥基庚酸或庚二酸半醛作為中心前體通向庚二胺的途徑
[0131] 在一些實施方案中，庚二胺從中心前體7-氨基庚酸合成，由歸類于，例如EC I. 2. 99. 6下的羧酸還原酶，例如car的基因產(chǎn)物（見上文）與磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶增 強(qiáng)子（例如由來自于枯草芽孢桿菌的sfp基因編碼（Genbank登錄號CAA44858. 1，SEQ ID NO: 14)或由來自于諾卡爾菌的npt基因編碼（Genbank登錄號ABI83656.1, SEQ ID NO: 15)) 的組合，或GriC和GriD的基因產(chǎn)物將7-氨基庚酸轉(zhuǎn)化為7-氨基庚醛；接著由co -轉(zhuǎn)氨酶 (例如歸類于，例如 EC 2. 6. 1. 18、EC 2. 6. 1. 19、EC 2. 6. 1. 29、EC 2. 6. 1. 48、EC 2. 6. 1. 82 下，例如SEQ IDs:N〇S:8-13,見上文）將7-氨基庚醛轉(zhuǎn)化為庚二胺。見圖4。
[0132] 由car的基因產(chǎn)物編碼的羧酸還原酶和來自于枯草芽孢桿菌的磷酸泛酰巰基乙 胺轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)子npt或sfp具有廣泛的底物特異性，包括末端的雙官能的C4和C5羧酸 (Venkitasubramanian 等，Enzyme and Microbial Technology, 2008, 42, 130 - 137)〇
[0133] 在一些實施方案中，庚二胺從中心前體7-羥基庚酸（其可以如圖5中所述產(chǎn) 生）合成，由歸類于，例如EC 1.2. 99. 6下的羧酸還原酶例如car的基因產(chǎn)物（見上 文）與磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng)子（例如由來自于枯草芽孢桿菌的sfp基因或 來自于諾卡爾菌的npt基因編碼）的組合，或GriC和GriD的基因產(chǎn)物（Suzuki等， J. Antibiot.，2007, 60 (6)，380 - 387)將7-羥基庚酸轉(zhuǎn)化為7-氨基庚醛；接著由歸 類于例如 EC 2. 6. 1. 18、EC 2. 6. 1. 19、EC 2. 6. 1. 29、EC 2. 6. 1. 48、EC 2. 6. 1. 82 下例 如SEQ IDs:N〇S:8-13的轉(zhuǎn)氨酶將7-氨基庚醛轉(zhuǎn)化為7-氨基庚醇，見上文；接 著由歸類于，例如 EC 1. 1. 1.-(例如 EC 1. 1. 1. 1、EC 1. 1. 1. 2、EC 1. 1. 1. 21、或 EC 1. 1. 1. 184)下的醇脫氫酶，例如YMR318C(歸類于例如EC 1. 1. 1. 2下，見Genbank登錄號 CAA90836. 1)或YqhD (來自于大腸桿菌，GenBank登錄號AAA69178. 1)的基因產(chǎn)物（Liu等， Microbiology, 2009, 155, 2078 - 2085 ;Larroy 等，2002, Biochem J.，361 (Pt 1)，163 - 172 ; Jarboe, 2011，Appl. Microbiol. Biotechnol.，89 (2)，249-257)，或具有 GenBank 登錄號 CAA81612. 1的蛋白（來自于嗜熱脂肪土芽孢桿菌）轉(zhuǎn)化為7-氨基庚醛；接著由歸類于例 如 EC 2.6. 1. 18、EC 2.6. 1. 19、EC 2.6. 1.29、EC 2.6. 1.48、或 EC 2.6. 1.82 下的轉(zhuǎn)氨 酶，例如SEQ ID N0s:8-13轉(zhuǎn)化為庚二胺，見上文。見圖4。
[0134] 在一些實施方案中，庚二胺從中心前體7-氨基庚酸合成，由例如歸類于，例如EC 2. 3. 1. 32的N-乙?；D(zhuǎn)移酶將7-氨基庚酸轉(zhuǎn)化為N7-乙酰-7-氨基庚酸；接著由歸類于， 例如EC 1. 2. 99. 6下的羧酸還原酶，例如car的基因產(chǎn)物（見上文）與磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn) 移酶增強(qiáng)子（例如由來自于枯草芽孢桿菌的sfp基因或來自于諾卡爾菌的npt基因編碼， 見上文）的組合，或GriC和GriD的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為N7-乙酰-7-氨基庚醛；接著由歸類于， 例如 EC 2. 6. 1. 18、EC 2. 6. 1. 19、EC 2. 6. 1. 29、EC 2. 6. 1. 48、EC 2. 6. 1. 46 或 EC 2. 6. 1. 82 下的轉(zhuǎn)氨酶例如SEQ ID N0s:8-13轉(zhuǎn)化為N7-乙酰-1，7-二氨基庚烷，見上文；接著由 歸類于例如EC 3.5. 1.62下的乙酰腐胺脫?；皋D(zhuǎn)化為庚二胺。見圖4。
[0135] 在一些實施方案中，庚二胺從中心前體庚二酸半醛合成，由歸類于例如EC 1. 2. 99. 6下的羧酸還原酶例如car的基因產(chǎn)物（見上文）與磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶增強(qiáng) 子（例如由來自于枯草芽孢桿菌的sfp基因或來自于諾卡爾菌的npt基因編碼）的組合， 或GriC和GriD的基因產(chǎn)物將庚二酸半醛轉(zhuǎn)化為庚二醛；接著由歸類于例如EC 2. 6. 1. 18、 EC 2. 6. 1. 19或EC 2. 6. 1. 48下的轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化為7-氨基庚醛；接著由歸類于例如EC 2. 6. 1. 18、EC 2. 6. 1. 19、EC 2. 6. 1. 29、EC 2. 6. 1. 48、EC 2. 6. 1. 46 或 EC 2. 6. 1. 82 下的 轉(zhuǎn)氨酶例如SEQ ID N0s:8-13轉(zhuǎn)化為庚二胺，見上文。見圖4。
[0136] 使用庚二酸和庚二酸半醛作為中心前體通向7-羥基庚酸和1，7-庚二醇的途徑
[0137] 在一些實施方案中，7-羥基庚酸從中心前體庚二酸合成，由歸類于，例如EC 1. 2. 99. 6下的羧酸還原酶，例如car的基因產(chǎn)物（見上文）與磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶 增強(qiáng)子（例如由來自于枯草芽孢桿菌的sfp基因或來自于諾卡爾菌的npt基因編碼） 的組合，或GriC和GriD的基因產(chǎn)物將庚二酸轉(zhuǎn)化為庚二酸半醛；接著由歸類于例如EC 1. 1. 1. 258下的6-羥基己酸脫氫酶，例如來自ChnD的基因，或歸類于例如EC 1. 1. 1.-下 的5-羥基戊酸脫氫酶，例如CpnD的基因產(chǎn)物（見，例如Iwaki等，2002, Appl. Environ. Microbiol.，68 (11) : 5671 - 5684)，或 4_ 羥基丁酸脫氛酶例如 gabD (見，例如 LUtke-Evers loh&SteinbUchel, 1999, FEMS Microbiology Letters，181(l):63_ 71)轉(zhuǎn)化為 7-羥基庚 酸。見圖5。
[0138] 在一些實施方案中，7-羥基庚酸從中心前體庚二酰-CoA合成，由歸類于例如 EC 1. 2. 1. 10下的乙?；┟摎涿福鏟duB或PduP的基因產(chǎn)物將庚二酰-CoA轉(zhuǎn)化為 庚二酸半醛；接著由歸類于，例如EC 1. 1. 1. 258下的6-羥基己酸脫氫酶，例如由ChnD編 碼，或歸類于例如1. 1. 1.-下的羥基戊酸脫氫酶，例如CpnD的基因產(chǎn)物，或者歸類于例如 1. 1. 1.-下的羥基丁酸脫氫酶，例如gabD的基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為7-羥基庚酸。見圖5。
[0139] 在一些實施方案中，1，7-庚二醇從中心前體7-羥基庚酸合成，由歸類于例如EC 1. 2. 99. 6下的羧酸還原酶，例如car的基因產(chǎn)物（見上文）與磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶增 強(qiáng)子（例如由來自于枯草芽孢桿菌的sfp基因或來自于諾卡爾菌的npt基因編碼）的組 合，或GriC和GriD的基因產(chǎn)物將7-羥基庚酸轉(zhuǎn)化為7-羥基庚醛；接著由歸類于例如EC 1. 1. 1.-例如 EC 1. 1. 1. 1、EC 1. 1. 1. 2、EC 1. 1. 1. 21 或 EC 1. 1. 1. 184)下的醇脫氫酶，例 如 YMR318C 或 YqhD 的基因產(chǎn)物（見，例如 Liu 等，Microbiology, 2009, 155, 2078 - 2085 ; Larroy 等，2002, Biochem J.，361 (Pt 1)，163 - 172;或 Jarboe，2011，Appl. Microbiol. Biotechnol.，89 (2)，249-257)或具有GenBank登錄號CAA81612. 1 (來自嗜熱脂肪土芽孢桿 菌（Geobacillus stearothermophilus))的蛋白將7-羥基庚醛轉(zhuǎn)化為1,7庚二醇。見圖 6〇
[0140] 培養(yǎng)策略
[0141] 在一些實施方案中，所述培養(yǎng)策略需要達(dá)到厭氧培養(yǎng)、微需氧、或混合的氧/反 硝化條件。在體外表征為氧敏感的酶需要微氧的培養(yǎng)策略，維持非常低的溶解氧濃度 (見，例如 Chayabatra&Lu_Kwang，Appl. Environ. Microbiol. ,2000, 66 (2)，493 0 498; Wilson 和 Bouwer, 1997,Journal of Industrial Microbiology and Biotechnolo gy，18(2-3)，116-130) 〇
[0142] 在一些實施方案中，培養(yǎng)策略需要營養(yǎng)物限制諸如氮、磷酸鹽或氧限制。
[0143] 在一些實施方案中，可以使用除了氧之外的最終電子受體例如硝酸鹽。
[0144] 在一些實施方案中，可以采用使用例如陶瓷中空纖維膜的細(xì)胞保留策略來實現(xiàn)并 維持補(bǔ)料分批或連續(xù)發(fā)酵期間的高細(xì)胞密度。
[0145] 在一些實施方案中，在一種或多種C7結(jié)構(gòu)單元合成中對發(fā)酵補(bǔ)料的主要碳源可 以源自生物或非生物給料。
[0146] 在一些實施方案中，生物給料可以是、可以包括或者可以源自單糖、二糖、木質(zhì)纖 維素、半纖維素、纖維素、木質(zhì)素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、農(nóng)業(yè)廢物、濃縮 酒糟或城市廢物。
[0147] 已經(jīng)在幾種微生物（諸如大腸桿菌、鉤蟲貪銅菌、食油假單胞菌、惡臭假單胞 菌和解脂耶羅維亞酵母）中證明了源自生物柴油生產(chǎn)的粗制甘油的有效分解代謝（Lee 等，Appl.Biochem.Biotechnol. ,2012, 166:1801 - 1813 ;Yang 等，Biotechnology for Biofuels, 2012, 5:13 ;Meijnen 等，Appl. Microbiol. Biotechnol.，2011，90:885-893) 〇
[0148] 已經(jīng)在幾種生物體（諸如鉤蟲貪銅菌和惡臭假單胞菌）中在經(jīng)由前體丙酰 基-CoA合成3-羥基戊酸中證明了木質(zhì)纖維素衍生的乙酰丙酸的有效分解代謝（Jaremko 和 Yu, Journal of Biotechnology, 2011，155, 2011，293 - 298 ;Martin 和 Prather, Journal of Biotechnology, 2009, 139, 61 - 67)〇
[0149] 已經(jīng)在幾種微生物（諸如惡臭假單胞菌、鉤蟲貪銅菌）中證明了木質(zhì)素衍 生的芳香族化合物諸如苯甲酸類似物的有效分解代謝（Bugg等，Current Opinion in Biotechnology, 2011，22, 394 - 400 ;P6rez_Pantoja 等，F(xiàn)EMS Microbiol. Rev.，2008, 32, 736 - 794)。
[0150] 已經(jīng)在幾種微生物（包括解脂耶羅維亞酵母）中證明了農(nóng)業(yè)廢物（諸如橄欖磨坊 廢水）的有效利用（Papanikolaou 等，Bioresour. Technol.，2008, 99 (7) : 2419-2428) 〇
[0151] 已經(jīng)對幾種微生物（諸如大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌和德氏乳桿菌和 乳酸乳球菌）證明了可發(fā)酵糖類（諸如源自纖維素、半纖維素、甘蔗和甜菜糖 蜜、木薯、玉米和其它農(nóng)業(yè)來源的單糖和二糖）的有效利用（參見例如Hermann 等，Journal of Biotechnology,2003，104: 155 - 172 ;Wee 等，F(xiàn)ood Technol. Biotechnol.，2006, 44 (2) : 163 - 172 ;0hashi 等，Journal of Bioscience and Bioengine ering, 1999, 87(5):647-654)〇
[0152] 已經(jīng)對鉤蟲貪銅菌證明了源自多種農(nóng)業(yè)木質(zhì)纖維素來源的糠醛的有效利用（Li 等，Biodegradation, 2011，22:1215 - 1225)。
[0153] 在一些實施方案中，非生物給料可以是或者可以源自天然氣、合成氣、0)2/氏、甲 醇、乙醇、苯甲酸、來自環(huán)己烷氧化過程的非揮發(fā)性殘留物（NVR)或堿洗廢物流、或?qū)Ρ蕉?甲酸/異酞酸混合物廢物流。
[0154] 已經(jīng)對甲基營養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母證明了甲醇的有效分解代謝。
[0155] 已經(jīng)對克魯佛梭菌證明了乙醇的有效分解代謝（Seedorf等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105(6)2128-2133)。
[0156] 已經(jīng)對鉤蟲貪銅菌證明了 0)2和H2(其可以源自天然氣和其它化學(xué)和石油化學(xué)來 源）的有效分解代謝（Prybylski 等，Energy, Sustainability and Society, 2012, 2:11) 〇
[0157] 已經(jīng)對多種微生物（諸如楊氏梭菌和自產(chǎn)乙醇梭菌）證明了合成氣的有效分解代 謝（I〈6pke等，Applied and Environmental Microbiology，2011，77(15):5467_5475)〇
[0158] 已經(jīng)對多種微生物（諸如食酸代爾夫特菌和鉤蟲貪銅菌證明了來自環(huán)己烷過程 的非揮發(fā)性殘留物廢物流的有效分解代謝（Ramsay等，Applied and Environmental Micr obiology，1986, 52(1):152 - 156)。
[0159] 在一些實施方案中，宿主微生物是原核生物。例如，原核生物可以是來自以下的細(xì) 菌：埃希氏菌屬如大腸桿菌；梭菌屬如楊氏梭菌、自產(chǎn)乙醇梭菌或者克魯佛梭菌；棒狀桿菌 屬如谷氨酸棒狀桿菌；貪銅菌屬如鉤蟲貪銅菌或者耐金屬貪銅菌；假單胞菌屬如熒光假單 胞菌、惡臭假單胞菌或者食油假單胞菌；代爾夫特菌屬如食酸代爾夫特菌；芽孢桿菌屬如 枯草芽胞桿菌；乳桿菌屬如德氏乳桿菌；或者乳球菌屬如乳酸乳球菌。此類原核生物也可 以是構(gòu)建能夠生成一種或多種C7結(jié)構(gòu)單元的本文中描述的重組宿主細(xì)胞的基因來源。
[0160] 在一些實施方案中，宿主微生物是真核生物。例如，真核生物可以是絲狀真菌， 例如來自曲霉屬如黑曲霉的?；蛘?，真核生物可以是酵母，例如來自酵母屬如釀酒酵母； 來自畢赤氏酵屬如巴斯德畢赤酵母；來自耶羅維亞酵母屬如解脂耶羅維亞酵母；來自伊薩 酵母屬如東方伊薩酵母；來自德巴利酵母屬如漢遜德巴利酵母；來自Arxula屬如Arxula adenoinivorans ;或者來自克魯維酵母菌屬如乳酸克魯維酵母菌的。此類真核生物也可以 是構(gòu)建能夠生成一種或多種C7結(jié)構(gòu)單元的本文中描述的重組宿主細(xì)胞的基因來源。
[0161] 代謝工程
[0162] 本文件提供方法，所述方法牽涉對所有上述途徑描述的少于所有的步驟。這種方 法可牽涉例如此類步驟中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多個。在這種方法包含 少于所有步驟的情況下，第一個且在一些實施方案中唯一的步驟可為所列步驟中的任何步 驟。
[0163] 此外，本文中描述的重組宿主可以包括上述酶中的任何組合，使得所述步驟中的 一個或者多個，例如此類步驟中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多個可以在重組宿主內(nèi) 實施。本文件提供所列出的和基因工程化以表達(dá)本文件中列舉的任何酶的一種或者多中 (例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或者更多種）重組形式的任何屬和種的宿主細(xì)胞。如 此，例如，宿主細(xì)胞可含有外源核酸，其編碼催化本文中描述的任何途徑的一個或者多個步 驟的酶。
[0164]另外，本文件認(rèn)識到，在酶已經(jīng)被描述為接受CoA活化的底物的情況下，存在與 [acp]結(jié)合底物相關(guān)的相似的酶活性，其不一定為相同的酶種類。
[0165] 此外，本文件認(rèn)識到，在酶已經(jīng)被描述為接受底物的（R)_對映異構(gòu)體的情況下， 存在與底物的（S)_對映異構(gòu)體相關(guān)的相似的酶活性，其不一定為相同的酶種類。
[0166] 本文件還認(rèn)識到，在已經(jīng)顯示酶接受特定輔因子如NADPH或者共底物如乙酰 基-CoA的情況下，許多酶在催化特定酶活性中在接受大量不同輔因子或者共底物方面是 泛宿主性的（promiscuous)。此外，本文件認(rèn)識到，在酶對例如特定輔助因子如NADH具有高 特異性的情況下，對輔助因子NADPH具有高特異性的具有相似或者相同活性的酶可為不同 的酶種類。
[0167] 在一些實施方案中，本文中概述的途徑中的酶是經(jīng)由非直接或者合理酶設(shè)計方法 的酶工程的結(jié)果，目的在于改善活性、改善特異性、降低反饋抑制、降低阻抑、改善酶溶解 度、改變立體特異性，或者改變輔助因子特異性。
[0168] 在一些實施方案中，可以將本文概述的途徑中的酶經(jīng)由附加型或者染色體整合方 法基因給予（即，