碼N-末端His標簽的核苷酸序列添加至分別編碼SEQ ID N0:8、10、和11的 轉氨酶的來自紫色色桿菌、丁香假單胞菌、和球形紅桿菌基因（參見圖7)，使得可以產(chǎn) 生N-末端有HIS標簽的轉氨酶。將經(jīng)修飾基因在T7啟動子的控制下克隆入pET21a 表達載體中。將每種表達載體轉化入BL21[DE3]大腸桿菌宿主中。于37°C在含有50mL LB 培養(yǎng)基和抗生素選擇壓力的250mL搖瓶培養(yǎng)物中在以230rpm搖動的情況中培養(yǎng)每種所得 的重組大腸桿菌菌株。使用ImM IPTG于16°C誘導每種培養(yǎng)物過夜。
[0223] 經(jīng)由離心收獲來自每種經(jīng)誘導的搖瓶培養(yǎng)物的團粒。重懸每個團粒，并經(jīng)由超聲 處理裂解。經(jīng)由離心分開細胞碎片與上清液，并且立即在酶活性測定法中使用無細胞提取 物。
[0224] 在緩沖液中實施逆向（即7-氨基庚醇至7-氧代庚醇）的酶活性測定法，所述緩沖 液由終濃度50mM HEPES緩沖液（pH = 7. 5)、10mM 7-氨基庚醇、10mM丙酮酸和100 y M吡哆 5'磷酸鹽組成。通過添加co-轉氨酶基因產(chǎn)物或空載體對照的無細胞提取物到含有7-氨 基庚醇的測定緩沖液啟動每個酶活性測定反應，并在以250rpm搖動的情況下于25°C溫育4 小時。經(jīng)由RP-HPLC量化L-丙氨酸形成。
[0225] 每種沒有7-氨基庚醇的僅酶具有丙酮酸至L-丙氨酸的低基線轉化。參見圖14。
[0226] SEQ ID N0 8、10和11的基因產(chǎn)物接受7-氨基庚醇作為底物，如相對于空載體對 照確認的（參見圖19)，并且合成7-氧代庚醇作為反應產(chǎn)物。鑒于co-轉氨酶活性的可逆 性（參見實施例2)，可以推斷SEQ ID 8、10和11的基因產(chǎn)物接受7-氧代庚醇作為底物，并 且形成7-氨基庚醇。
[0227] 實施例6: -轉氨酶使用庚二胺作為底物并形成7-氨基庚醛的酶活性
[0228] 將編碼N-末端His標簽的序列添加至分別編碼SEQ ID N0:8-13的轉氨酶 的紫色色桿菌、銅綠假單胞菌、丁香假單胞菌、球形紅桿菌、大腸桿菌、和河流弧菌基因（參 見圖7)，使得可以產(chǎn)生N-末端有HIS標簽的《 -轉氨酶。將經(jīng)修飾基因在T7啟動子的控 制下克隆入pET21a表達載體中。將每種表達載體轉化入BL21[DE3]大腸桿菌宿主中。于 37°C在含有50mL LB培養(yǎng)基和抗生素選擇壓力的250mL搖瓶培養(yǎng)物中在以230rpm搖動的 情況中培養(yǎng)每種所得的重組大腸桿菌菌株。使用ImM IPTG于16°C誘導每種培養(yǎng)物過夜。
[0229] 經(jīng)由離心收獲來自每種經(jīng)誘導的搖瓶培養(yǎng)物的團粒。重懸每個團粒，并經(jīng)由超聲 處理裂解。經(jīng)由離心分開細胞碎片與上清液，并且立即在酶活性測定法中使用無細胞提取 物。
[0230] 在緩沖液中實施逆向（即庚二胺至7-氨基庚醛）的酶活性測定法，所述緩沖液由 終濃度50mM HEPES緩沖液（pH = 7. 5)、10mM庚二胺、10mM丙酮酸和100 y M吡哆5'磷酸 鹽組成。通過添加co-轉氨酶基因產(chǎn)物或空載體對照的無細胞提取物到含有庚二胺的測定 緩沖液啟動每個酶活性測定反應，并在以250rpm搖動的情況下于25°C溫育4小時。經(jīng)由 RP-HPLC量化L-丙氨酸形成。
[0231] 每種沒有庚二胺的僅酶具有丙酮酸至L-丙氨酸的低基線轉化。參見圖14。
[0232] SEQ ID N0 8-13的基因產(chǎn)物接受庚二胺作為底物，如相對于空載體對照確認的 (參見圖17)，并且合成7-氨基庚醛作為反應產(chǎn)物。鑒于co-轉氨酶活性的可逆性（參見 實施例2)，可以推斷SEQ ID 8 - 13的基因產(chǎn)物接受7-氨基庚醛作為底物，并且形成庚二 胺。
[0233] 實施例7 :羧酸還原酶對于N7-乙酰-7-氨基庚酸形成N7-乙酰-7-氨基庚醛的 酶活性
[0234] -式三份在緩沖液中測定用于將N7-乙酰基-7-氨基庚酸轉化成N7-乙酰 基-7-氨基庚醛的N末端有His標簽的SEQ ID N0:3、6、和7的羧酸還原酶的活性（參見實 施例4,及圖7)，所述緩沖液由終濃度50mM HEPES緩沖液（pH = 7. 5)、2mM N7-乙?；?7-氨 基庚酸、10mM MgCl2、lmM ATP、和ImM NADPH組成。通過添加純化的羧酸還原酶和磷酸泛酰 巰基乙胺基轉移酶或空載體對照至含有N7-乙?；?7-氨基庚酸的測定緩沖液啟動測定 法，然后于室溫溫育20分鐘。通過于340nm的吸光度監(jiān)測NADPH的消耗。每種沒有N7-乙 酰基-7-氨基庚酸的僅酶對照表明NADPH的低基線消耗。參見圖9。
[0235] SEQIDN0 3、6、和7的基因產(chǎn)物（其得到sfp的基因產(chǎn)物增強）接受N7-乙酰 基-7-氨基庚酸作為底物，如相對于空載體對照確認的（參見圖12)，并且合成N7-乙酰 基-7-氨基庚醛。
[0236] 實施例8 : -轉氨酶使用N7-乙酰-1，7-二氨基庚烷并形成N7-乙酰-7-氨基庚 醛的酶活性
[0237] 在緩沖液中測定用于將N7-乙?；?1，7-二氨基庚烷轉化成N7-乙酰基-7-氨 基庚醛的N末端有His標簽的SEQ ID N0:8-13的轉氨酶的活性（參見實施例6,及圖 7)，所述緩沖液由終濃度50mM HEPES緩沖液（pH = 7. 5)、10mM N7-乙?；?1，7-二氨基庚 烷、10mM丙酮酸和100 yM吡哆5'磷酸鹽組成。通過添加轉氨酶或空載體對照的無細 胞提取物至含有N7-乙?；?1，7-二氨基庚烷的測定緩沖液啟動每種酶活性測定反應，然 后在以250rpm搖動的情況中于25°C溫育4分鐘。經(jīng)由RP-HPLC量化L-丙氨酸的形成。
[0238] 每種沒有N7-乙酰基-1，7-二氨基庚烷的僅酶對照表明丙酮酸至L-丙氨酸的低 基線轉化。參見圖14。
[0239] SEQIDNO:8 - 13的基因產(chǎn)物接受N7-乙?；?1，7-二氨基庚烷作為底物，如相對 于空載體對照確認的（參見圖18)，并且合成N7-乙酰基-7-氨基庚醛作為反應產(chǎn)物。
[0240] 鑒于轉氨酶活性的可逆性（參見實施例2)，SEQIDN0:8-13的基因產(chǎn)物接受 N7-乙?；?7-氨基庚醛作為底物，形成N7-乙酰基-1，7-二氨基庚烷。
[0241] 實施例9 :羧酸還原酶使用庚二酸半醛作為底物并形成庚二醛的酶活性
[0242] 使用庚二酸半醛作為底物測定N-末端有His標簽的SEQ ID N0 7的羧酸還原酶 (參見實施例4和圖7)。一式三份在緩沖液中實施酶活性測定法，所述緩沖液由終濃度50mM HEPES 緩沖液（pH = 7. 5)、2mM 庚二酸半醛、10mM MgCl2、lmM ATP、和 ImM NADPH 組成。通過 添加純化的羧酸還原酶和磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶或空載體對照至含有庚二酸半醛的 測定緩沖液啟動測定法，然后于室溫溫育20分鐘。通過于340nm的吸光度監(jiān)測NADPH的消 耗。每種沒有庚二酸半醛的僅酶對照表明NADPH的低基線消耗。參見圖9。
[0243] SEQ IDN07的基因產(chǎn)物（其得到sfp的基因產(chǎn)物增強）接受庚二酸半醛作為底 物，如相對于空載體對照確認的（參見圖13)，并且合成庚二醛。
[0244] 其它實施方案
[0245] 應理解的是，盡管協(xié)同發(fā)明的具體描述描述了本發(fā)明，但是前面的描述意圖說明 并且不限制發(fā)明的范圍，發(fā)明的范圍由所附權利要求的范圍限定。其它方面、優(yōu)點和修改也 在權利要求的范圍內。
【主權項】
1. 一種用于生物合成選自下組的產(chǎn)物的方法：庚二酸、7-氨基庚酸、7-羥基庚酸、庚二 胺和1，7-庚二醇，所述方法包括從苯甲酰-CoA酶促合成七碳鏈式脂族主鏈，以及在所述主 鏈中酶促形成兩個選自下組的末端官能團：羧基、胺和羥基基團，從而形成所述產(chǎn)物。2. 權利要求1的方法，其中所述七碳鏈式脂族主鏈是庚二酰-CoA。3. 權利要求2的方法，其中庚二酰-CoA通過苯甲酰-CoA降解從分支酸或苯甲酸酶促 合成。4. 權利要求3的方法，其中苯甲酰-CoA還原酶將苯甲酰-CoA轉化為環(huán)己-1，5-二 稀_1_幾基 -CoA。5. 權利要求3或4任一項的方法，其中分支酸由分支酸裂合酶轉化為4-羥基苯甲酸， 或者分支酸由鄰氨基苯甲酸合酶轉化為鄰氨基苯甲酸。6. 權利要求3-5任一項的方法，其中庚二酰-CoA由2-酮環(huán)己烷-1-羧基-CoA水解酶 從2_酬環(huán)己燒-1-駿基-CoA合成。7. 權利要求1-6任一項的方法，其中所述兩個末端官能團是相同的。8. 權利要求1-6任一項的方法，其中所述兩個末端官能團是不同的。9. 權利要求8的方法，其中所述產(chǎn)物包含末端胺和末端羧基基團。10. 權利要求8的方法，其中所述產(chǎn)物包含末端羥基基團和末端羧基基團。11. 權利要求1-7任一項的方法，其中所述兩個末端官能團是胺。12. 權利要求1-7任一項的方法，其中所述兩個末端官能團是羥基基團。13. 權利要求10或12的方法，其中6-羥基己酸脫氫酶、5-羥基戊酸脫氫酶、4-羥基丁 酸脫水酶、或醇脫氫酶酶促形成所述兩個羥基基團。14. 權利要求1-10任一項的方法，其中硫酯酶、醛脫氫酶、7-氧代庚酸脫氫酶、6-氧代 己酸脫氫酶、CoA-轉移酶、或可逆CoA-連接酶酶促形成末端羧基基團。15. 權利要求14的方法，其中所述硫酯酶與列于SEQ ID N0:1中的氨基酸序列具有至 少70 %的序列同一性。16. 權利要求9或11的方法，其中Co-轉氨酶或脫乙?；该复傩纬伤霭坊鶊F。17. 權利要求16的方法，其中所述轉氨酶與列于SEQ ID NO. 8-13中的任一氨基酸 序列具有至少70%的序列同一性。18. 權利要求1-12任一項的方法，其中羧酸還原酶和磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶形成 末端醛基團，作為形成所述產(chǎn)物的中間物。19. 權利要求18的方法，其中所述羧酸還原酶與列于SEQ ID NO. 2-7中的任一氨基酸 序列具有至少70%的序列同一性。20. 前述權利要求任一項的方法，其中所述方法通過發(fā)酵在重組宿主中進行。21. 權利要求20的方法，其中所述宿主經(jīng)歷厭氧、微氧或混合的氧/反硝化培養(yǎng)條件下 的培養(yǎng)策略。22. 權利要求20或21的方法，其中所述宿主在營養(yǎng)物限制的條件下培養(yǎng)。23. 根據(jù)權利要求20-22任一項的方法，其中所述宿主使用陶瓷中空纖維膜保留以維 持發(fā)酵期間的高細胞密度。24. 權利要求20-23任一項的方法，其中最終電子受體是硝酸鹽。25. 權利要求20-24任一項的方法，其中對發(fā)酵進料的主要碳源衍生自生物或非生物 給料。26. 權利要求25的方法，其中所述生物給料是以下物質，或衍生自以下物質：單糖、二 糖、木質纖維素、半纖維素、纖維素、木質素、乙酰丙酸、甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、農(nóng)業(yè) 廢物、濃縮的酒糟可溶物或城市廢物。27. 權利要求25的方法，其中所述非生物給料是以下物質，或衍生自以下物質：天然 氣、合成氣、C02/H 2、甲醇、乙醇、苯甲酸、來自環(huán)己烷氧化過程的非揮發(fā)性殘留物（NVR)堿洗 廢物流，或對苯二甲酸/異酞酸混合物廢物流。28. 權利要求20-27任一項的方法，其中所述宿主是原核生物。29. 權利要求28的方法，其中所述原核生物來自埃希氏菌屬（Escherichia)如 大腸桿菌（Escherichia coli);來自梭菌屬（Clostridia)如楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)、自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)或者克魯佛梭 菌（Clostridium kluyveri);來自棒狀桿菌屬（Corynebacteria)如谷氨酸棒狀桿 菌（Corynebacterium glutamicum);來自貪銅菌屬（Cupriavidus)如鉤蟲貪銅菌 (Cupriavidus necator)或者耐金屬貪銅菌（Cupriavidus metalIidurans);來自假單 胞菌屬（Pseudomonas)如焚光假單胞菌（Pseudomonas fIuorescens)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)或者食油假單胞菌（Pseudomonas oleavorans);來自代爾夫特菌 屬（Delftia)如食酸代爾夫特菌（Delftia acidovorans);來自芽孢桿菌屬（Bacillus) 如枯草芽胞桿菌（Bacillus subtillis);來自乳桿菌屬（Lactobacillus)如德氏乳桿 菌（Lactobacillus delbrueckii);或者來自乳球菌屬（Lactococcus)如乳酸乳球菌 (Lactococcus Iactis)或來自紅球菌屬（Rhodococcus)如馬紅球菌（Rhodococcus equi)。30. 權利要求20-27任一項的方法，其中所述宿主是真核生物。31. 權利要求30的方法，其中所述真核生物來自曲霉屬（Aspergillus)如黑曲 霉（Aspergillus niger);來自酵母屬（Saccharomyces)如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);來自畢赤酵母屬（Pichia)如巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris);來自 耶羅維亞酵母屬（Yarrowia)如解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia Iipolytica);來自伊薩 酵母屬（Issatchenkia)如東方伊薩酵母（Issathenkia orientalis);來自德巴利酵母 屬（Debaryomyces)如漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii);來自 Arxula 屬如 Arxula adenoinivorans;或者來自克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces)如乳酸克魯維酵母 菌（Kluyveromyces Iactis)〇32. 權利要求20-31任一項的方法，其中所述宿主對高濃度C7結構單元的耐受通過在 選擇環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)改善。33. 權利要求20-32任一項的方法，其中所述宿主含有一種或多種以下弱化的酶：聚合 物合酶、NADPH特異性L-谷氨酸脫氫酶、NADPH-消耗型轉氫酶、庚二酰-CoA脫氫酶；降解 C7結構單元及其前體的酰基-CoA脫氫酶；戊二酰-CoA脫氫酶；或庚二酰-CoA合成酶。34. 權利要求20-33任一項的方法，其中所述宿主過表達編碼以下物質的一種或多 種基因：6_磷酸葡糖酸脫氫酶；轉酮醇酶；反饋抗性莽草酸激酶；反饋抗性2-脫氫-3-脫 氧磷酸庚酸醛糖；吡啶（puridine)核苷酸轉氫酶；甘油醛-3P-脫氫酶；蘋果酸酶；葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶；果糖1，6二磷酸酶；鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶、L-丙氨酸脫氫酶； NADH-特異性L-谷氨酸脫氫酶；二胺轉運體；二羧酸轉運體；和/或多藥物轉運體。35. -種重組宿主，其包含至少一種外源性核酸，所述外源性核酸編碼（i)分支酸裂合 酶或鄰氨基苯甲酸合酶；（ii)苯甲酰-CoA還原酶和（iii) 2-酮環(huán)己烷-1-羧基-CoA水解 酶，所述宿主生產(chǎn)庚二酰-CoA。36. 權利要求35的重組宿主，所述宿主進一步包含一種或多種以下物質：4-羥基 苯甲酸-CoA連接酶，琥珀酰-CoA:苯甲酸CoA-轉移酶、4-羥基苯甲酰-CoA還原酶、環(huán) 己-1-烯-1-羧基-CoA脫氫酶、環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA水合酶，或2-羥基環(huán)己烷羧 基-CoA脫氫酶。37. 權利要求35的重組宿主，所述宿主進一步包含一種或多種以下物質：鄰氨基苯 甲酸CoA-連接酶、2-氨基苯甲酰-CoA氨裂合酶、環(huán)己-1-烯-1-羧基-CoA脫氫酶、環(huán) 己-1-烯-1-羧基-CoA水合酶、或2-羥基環(huán)己烷羧基-CoA脫氫酶。38. 權利要求35-37任一項的重組宿主，所述宿主包含至少一種編碼一種或多種以下 物質的外源性核酸：硫酯酶、醛脫氫酶、7-氧代庚酸脫氫酶、6-氧代己酸脫氫酶、戊烯二酸 CoA-轉移酶、可逆琥珀酰-CoA-連接酶、乙?；┟摎涿?、或羧酸還原酶，所述宿主生產(chǎn)庚 二酸或庚二酸半醛。39. 權利要求38的重組宿主，所述宿主包含至少一種編碼《 -轉氨酶的外源性核酸，所 述宿主生產(chǎn)7-氨基庚酸。40. 權利要求38的重組宿主，所述宿主進一步包含至少一種編碼以下物質的外源性核 酸：4_羥基丁酸脫氫酶，5-羥基戊酸脫氫酶或6-羥基己酸脫氫酶，所述宿主生產(chǎn)7-羥基庚 酸。41. 權利要求38-40任一項的重組宿主，所述宿主進一步包含至少一種編碼以下物質 的外源性核酸：羧酸還原酶，Co-轉氨酶，脫乙?；?，N-乙酰轉移酶，或醇脫氫酶，所述宿 主生廣庚^?胺。42. 權利要求40的宿主，所述宿主進一步包含至少一種編碼羧酸還原酶或醇脫氫酶的 外源性核酸，所述宿主生產(chǎn)1，7-庚二醇。
【專利摘要】本申請描述了通過在C7脂族主鏈底物中形成兩個選自羧基、胺或羥基基團的末端官能團來生產(chǎn)庚二酸、7-氨基庚酸、7-羥基庚酸、庚二胺或1,7-庚二醇的生物化學途徑，所述C7脂族主鏈底物從分支酸或苯甲酸生產(chǎn)。本文所述的這些途徑、代謝工程和培養(yǎng)策略依賴于厭氧苯甲酰-CoA降解途徑的酶。
【IPC分類】C12P7/42, C12P7/18, C12P7/44, C12N15/63, C12P13/00
【公開號】CN105008543
【申請?zhí)枴緾N201380073745
【發(fā)明人】A.L.博特斯, A.V.E.康拉迪, 陳昌林, P.S.珀爾曼
【申請人】英威達技術有限責任公司
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2013年12月23日
【公告號】EP2938734A2, US20140193861, WO2014105796A2, WO2014105796A3