通過(guò)在宿主生物體中具有多個(gè)拷貝的基因來(lái)過(guò)表達(dá)）至所得的遺傳修飾 的生物體中。
[0169] 在一些實(shí)施方案中，可以利用基因組級(jí)別（genome-scale)系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)如通 量平衡分析來(lái)設(shè)計(jì)用于將碳流量引導(dǎo)至C7結(jié)構(gòu)單元的基因組級(jí)別的弱化或者敲除策略。
[0170] 弱化策略包括但不限于使用轉(zhuǎn)座子、同源重組（雙交叉方法）、誘變、酶抑制劑和 RNA 干擾（RNAi) 〇
[0171]在一些實(shí)施方案中，可以利用通量組（fluxomic)、代謝物組（metabolomic)和轉(zhuǎn) 錄物組（transcriptomal)數(shù)據(jù)來(lái)告知或者支持基因組級(jí)別的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，由此在將 碳流量導(dǎo)向C7結(jié)構(gòu)單元中設(shè)計(jì)基因組級(jí)別的弱化或者敲除策略。
[0172] 在一些實(shí)施方案中，宿主微生物的對(duì)高濃度的C7結(jié)構(gòu)單元的耐受性可以通過(guò)在 選擇性環(huán)境中的連續(xù)培養(yǎng)來(lái)改善。
[0173] 在一些實(shí)施方案中，可以弱化或增強(qiáng)宿主微生物的內(nèi)源生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)以（1)保證 來(lái)自于莽草酸的分支酸的細(xì)胞內(nèi)可用度，（2)創(chuàng)造ATP或NADP的不平衡，其僅可以通過(guò)C7 結(jié)構(gòu)單元的形成來(lái)平衡，（3)阻止通向和包括C7結(jié)構(gòu)單元的中心代謝產(chǎn)物或中心前體的降 解，和/或（4)保證從細(xì)胞的高效流出。
[0174] 在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)過(guò)表達(dá)6-磷酸葡糖酸脫氫酶，將碳通量導(dǎo)向 戊糖磷酸循環(huán)，來(lái)增加通向中心代謝產(chǎn)物分支酸的前體的供給，和/或過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)酮 醇酶來(lái)增加通向中心代謝產(chǎn)物分支酸的前體的供給（Lee等，2003, Biotechnology Progress, 19(5), 1444 - 1449)〇
[0175] 在一些實(shí)施方案中，可以在不受遺傳抑制的啟動(dòng)子下表達(dá)莽草酸激酶和/或2-脫 氫-3-脫氧磷酸庚酸醛糖。
[0176] 在一些實(shí)施方案中，分支酸對(duì)例如莽草酸激酶和/或2-脫氫-3-脫氧磷酸庚酸醛 糖的反饋抑制可以通過(guò)過(guò)表達(dá)反饋抗性的莽草酸激酶和/或反饋抗性的2-脫氫-3-脫氧 磷酸庚酸醛糖來(lái)減少。
[0177] 在一些實(shí)施方案中，可以在不受遺傳抑制的啟動(dòng)子下表達(dá)分支酸的生物合成途徑 中的一種或多種基因。
[0178] 在一些實(shí)施方案中，在N7結(jié)構(gòu)單元的合成途徑需要過(guò)量的NADPH輔助因子的情況 下，可以在宿主生物體中過(guò)表達(dá)P比啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因，例如UdhA(Brigham等，Advanced Biofuels and Bioproducts，2012, Chapter 39, 1065-1090)〇
[0179] 在一些實(shí)施方案中，在N7結(jié)構(gòu)單元的合成途徑需要過(guò)量的NADPH輔助因子的情況 下，可以在宿主生物體中過(guò)表達(dá)甘油醛-3P-脫氫酶基因，例如GapN(Brigham等，2012,見上 文）。
[0180] 在一些實(shí)施方案中，在N7結(jié)構(gòu)單元的合成途徑需要過(guò)量的NADPH輔助因子的情況 下，可以在宿主生物體中過(guò)表達(dá)蘋果酸酶基因，例如maeA或maeB (Brigham等，2012,見上 文）。
[0181] 在一些實(shí)施方案中，在N7結(jié)構(gòu)單元的合成途徑需要過(guò)量的NADPH輔助因子的情況 下，可以在宿主生物體中過(guò)表達(dá)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因，例如zwf(Lim等，Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 93(6), 543-549)〇
[0182] 在一些實(shí)施方案中，在N7結(jié)構(gòu)單元的合成途徑需要過(guò)量的NADPH輔助因子的情況 下，可以在宿主中過(guò)表達(dá)果糖1,6二磷酸酶基因，例如fbp(Becker et al.，Journal of Bi otechnology, 2007, 132, 99-109)〇
[0183] 在一些使用天然積累聚羥基鏈烷酸酯的宿主的實(shí)施方案中，可以在所述宿主菌株 中弱化編碼聚合物合酶的內(nèi)源性基因。
[0184] 在一些實(shí)施方案中，可以在宿主中過(guò)表達(dá)鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶。
[0185] 在一些實(shí)施方案中，在C7結(jié)構(gòu)單元的合成途徑需要過(guò)量的NADPH輔助因子的情況 下，可以弱化重組NADPH-消耗型轉(zhuǎn)氫酶。
[0186] 在一些實(shí)施方案中，可以弱化NADPH-特異性L-谷氨酸脫氫酶。
[0187] 在一些實(shí)施方案中，可以在宿主中過(guò)表達(dá)L-丙氨酸脫氫酶，來(lái)從丙酮酸再生L-丙 氨酸，作為《 _轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)的氨基供體。
[0188] 在一些實(shí)施方案中，可以在宿主中過(guò)表達(dá)NADH-特異性L-谷氨酸脫氫酶，來(lái)從 2_氧代戊二酸再生L-谷氨酸，作為《 -轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)的氨基供體。
[0189] 在一些實(shí)施方案中，可以弱化降解通向和包括C7結(jié)構(gòu)單元的中心代謝產(chǎn)物和 中心前體的酶，例如歸類于例如EC 1.3. 1.62下的庚二酰-CoA脫氫酶；歸類于例如EC 1.3. 8.7或EC 1.3. 8.1下的?；?CoA脫氫酶；和/或歸類于例如EC 1.3. 8. 6下的戊二 酰-CoA脫氫酶。
[0190] 在一些實(shí)施方案中，可以弱化通過(guò)輔酶A酯化激活C7結(jié)構(gòu)單元的內(nèi)源性酶，例如 CoA-連接酶，例如歸類于，例如EC 6. 2. 1. 14下的庚二酰-CoA合成酶。
[0191] 在一些實(shí)施方案中，C7結(jié)構(gòu)單元穿過(guò)細(xì)胞膜流出到細(xì)胞外基質(zhì)可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞膜 遺傳工程化結(jié)構(gòu)修飾，或增加與C7結(jié)構(gòu)單元相關(guān)的任意轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性來(lái)提高或放大。
[0192] 庚二胺的流出可以通過(guò)過(guò)表達(dá)廣泛底物范圍多藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)提高或放大，例如 來(lái)自枯草芽孢桿菌的 Bit (Woolridge 等，1997, J. Biol. Chem.，272(14) :8864 - 8866);來(lái) 自大腸桿菌的 AcrB 和 AcrD (Elkins&Nikaido, 2002, J. Bacteriol.，184 (23)，6490 - 6499) 或來(lái)自金黃色釀膿葡萄球菌的NorA(Ng等，1994, Antimicrob Agents Chemother, 38(6)，1345 - 1355)或來(lái)自枯草芽抱桿菌的 Bmr(Neyfakh，1992, Antimicrob Agents Chemother，36(2)，484 - 485)〇
[0193] 7-氨基庚酸和庚二胺的流出可以通過(guò)過(guò)表達(dá)可溶性轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)提高或放大，例如來(lái) 自于谷氛酸棒狀桿菌的 lysE 轉(zhuǎn)運(yùn)體（Bellmann 等，2001，Microbiology, 147, 1765 - 1774)。
[0194] 庚二酸的流出可以通過(guò)過(guò)表達(dá)二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)提高或放大，例如來(lái)自于谷氨酸棒 狀桿菌的 SucE 轉(zhuǎn)運(yùn)體（Huhn 等，Appl. Microbiol. &Biotech.，89 (2)，327 - 335)。
[0195] 使用重組宿主生產(chǎn)C7結(jié)構(gòu)單元
[0196] 通常，可以通過(guò)提供宿主微生物并且用含有如上文描述的合適碳源的培養(yǎng)基 培養(yǎng)提供的微生物生成一種或多種C7結(jié)構(gòu)單元。一般地，培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)條件可以 使得微生物生長(zhǎng)至足夠的密度，并且有效生成C7結(jié)構(gòu)單元。對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)工藝，可 以使用任何方法，諸如那些在別處描述的（Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology,2nd Edition, Editors:A. L. Demain and J.E.Davies, ASM Press ；and Principles of Fermentation Technology, P. F. Stanbury and A. Whitaker, Pergamon)〇簡(jiǎn) 言之，用特定的微生物接種含有合適培養(yǎng)基的大罐（例如，100加侖，200加侖，500加侖，或 更大的罐）。在接種后，溫育微生物以容許生成生物量。一旦達(dá)到期望的生物量，可以將含 有微生物的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到第二個(gè)罐。此第二個(gè)罐可以是任何大小。例如，第二個(gè)罐可以比/ 與第一個(gè)罐大、小或相同大小。通常，第二個(gè)罐大于第一個(gè)，從而可以對(duì)來(lái)自第一個(gè)罐的培 養(yǎng)液添加額外的培養(yǎng)基。另外，此第二個(gè)罐內(nèi)的培養(yǎng)基可以與第一個(gè)罐中使用的培養(yǎng)基相 同或不同。
[0197] -旦轉(zhuǎn)移，可以溫育微生物以容許生成C7結(jié)構(gòu)單元。一旦生成，可以使用任何方 法來(lái)分離C7結(jié)構(gòu)單元。例如，可以經(jīng)由吸附方法從發(fā)酵液選擇性回收C7結(jié)構(gòu)單元。在庚 二酸和7-氨基庚酸的情況中，所得的洗脫液可以經(jīng)由蒸發(fā)進(jìn)一步濃縮，經(jīng)由蒸發(fā)和/或冷 卻結(jié)晶來(lái)結(jié)晶，并且經(jīng)由離心回收晶體。在庚二胺和1，7-庚二醇的情況中，可以采用蒸餾 來(lái)實(shí)現(xiàn)期望的產(chǎn)物純度。
[0198] 本發(fā)明在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例不限制權(quán)利要求書中描述的本發(fā) 明范圍。 實(shí)施例
[0199] 實(shí)施例1 :硫酯酶使用庚二酰-CoA作為底物并形成庚二酸的酶活性
[0200] 編碼N端His標(biāo)簽的序列加到來(lái)自于大腸桿菌的編碼硫酯酶的tesB基因（SEQ IDN01，見圖7)，使得可以產(chǎn)生N端有HIS標(biāo)簽的硫酯酶。所述修飾的tesB基因克隆到 pET15b表達(dá)載體中，在T7啟動(dòng)子的控制下。所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21[DE3]大腸桿菌宿主 中。所得的重組大腸桿菌菌株在含有50mL Luria Broth(LB)培養(yǎng)基和抗生素選擇壓力的 500mL搖瓶中在37°C培養(yǎng)，在230rpm下振蕩。所述培養(yǎng)物使用0. 5mM IPTG在17°C誘導(dǎo)過(guò) 夜。
[0201] 通過(guò)離心從所述誘導(dǎo)的搖瓶培養(yǎng)物收獲團(tuán)粒。所述團(tuán)粒重懸并裂解于Y-per?溶 液中（ThermoScientific, Rockford, IL)。通過(guò)離心將細(xì)胞碎片從上清分離。使用Ni-親和 層析從所述上清純化硫酯酶，洗出液通過(guò)超濾進(jìn)行緩沖液交換并濃縮。
[0202] 酶活性試驗(yàn)以一式三份在由50mM磷酸鹽緩沖液（pH = 7. 4)、0.1 mM Ellman' s試劑 和667 yM的庚二酰-CoA (作為底物）組成的緩沖液中進(jìn)行。通過(guò)向所述含有庚二酰-CoA 的試驗(yàn)緩沖液中加入〇. 8 y M tesB基因產(chǎn)物起始酶活性試驗(yàn)反應(yīng)，并在37°C孵育20分鐘。 輔酶A的釋放通過(guò)在412nm處的吸光度來(lái)監(jiān)控。從活性酶試驗(yàn)的吸光度減去與只有底物的 對(duì)照相關(guān)的吸光度，所述對(duì)照含有經(jīng)煮沸的酶，并與空載體對(duì)照比較。tesB基因產(chǎn)物接受庚 二酰-CoA作為底物通過(guò)相對(duì)分光光度法確定（見圖8)，并合成庚二酸作為反應(yīng)產(chǎn)物。
[0203] 實(shí)施例2 :使用庚二酸半醛作為底物并且形成7-氨基庚酸的-轉(zhuǎn)氨酶的酶活性
[0204] 將編碼N-末端His標(biāo)簽的序列添加至分別編碼SEQIDN0:8、10、ll和13的轉(zhuǎn) 氨酶的來(lái)自紫色色桿菌、丁香假單胞菌、球形紅桿菌、和河流弧菌的基因（參見圖7)，使得 可以產(chǎn)生N-末端有HIS標(biāo)簽的co -轉(zhuǎn)氨酶。將每種所得的經(jīng)修飾基因在T7啟動(dòng)子的控制 下克隆入pET21a表達(dá)載體中，并且將每種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入BL21[DE3]大腸桿菌宿主中。于 37°C在含有50mL LB培養(yǎng)基和抗生素選擇壓力的250mL搖瓶培養(yǎng)物中在以230rpm搖動(dòng)的 情況中培養(yǎng)所得的重組大腸桿菌菌株。使用ImM IPTG于16°C誘導(dǎo)每種培養(yǎng)物過(guò)夜。
[0205] 經(jīng)由離心收獲來(lái)自每種經(jīng)誘導(dǎo)的搖瓶培養(yǎng)物的團(tuán)粒。重懸每個(gè)團(tuán)粒，并經(jīng)由超聲 處理裂解。經(jīng)由離心分開細(xì)胞碎片與上清液，并且立即在酶活性測(cè)定法中使用無(wú)細(xì)胞提取 物。
[0206] 在緩沖液中實(shí)施逆向（即7-氨基庚酸至庚二酸半醛）的酶活性測(cè)定法，所述緩沖 液由終濃度50mM HEPES緩沖液（pH = 7. 5)、10mM 7-氨基庚酸、10mM丙酮酸和100 y M吡哆 (pyridoxyl)5'磷酸鹽組成。通過(guò)添加〇-轉(zhuǎn)氨酶基因產(chǎn)物或空載體對(duì)照的無(wú)細(xì)胞提取物 到含有7-氨基庚酸的測(cè)定緩沖液?jiǎn)?dòng)每個(gè)酶活性測(cè)定反應(yīng)，并在以250rpm搖動(dòng)的情況下 于5°C溫育4小時(shí)。經(jīng)由RP-HPLC量化從丙酮酸形成L-丙氨酸。
[0207] 每種沒有7-氨基庚酸的僅酶對(duì)照表明丙酮酸至L-丙氨酸的低基線轉(zhuǎn)化。參見圖 14。SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 10、SEQ ID N0 11 和 SEQ ID N0 13 的基因產(chǎn)物接受 7-氨基 庚酸作為底物，如相對(duì)于空載體對(duì)照確認(rèn)的。參見圖15。
[0208] 對(duì)SEQ ID N0 10、SEQ ID N0 11和SEQ ID N0 13的轉(zhuǎn)氨酶確認(rèn)正向（即庚二酸 半醛至7-氨基庚酸）的酶反應(yīng)。在緩沖液中實(shí)施酶活性測(cè)定法，所述緩沖液由終濃度50mM HEPES緩沖液（pH = 7. 5)、10mM庚二酸半醛、10mM L-丙氨酸和100 y M吡哆5'磷酸鹽組 成。通過(guò)添加轉(zhuǎn)氨酶基因產(chǎn)物或空載體對(duì)照的無(wú)細(xì)胞提取物到含有庚二酸半醛的測(cè)定 緩沖液?jiǎn)?dòng)每個(gè)酶活性測(cè)定反應(yīng)，并在以250rpm搖動(dòng)的情況下于25°C溫育4小時(shí)。經(jīng)由 RP-HPLC量化丙酮酸的形成。
[0209] SEQ ID N0 10、SEQ ID N0 11和SEQ ID N0 13的基因產(chǎn)物接受庚二酸半醛作為 底物，如相對(duì)于空載體對(duì)照確認(rèn)的。參見圖16。確認(rèn)轉(zhuǎn)氨酶活性的可逆性，證明了 SEQ ID N0 8、SEQ ID N0 10、SEQ ID N0 11、和 SEQ ID N0 13 的轉(zhuǎn)氨酶接受庚二酸半醛作 為底物，并且合成7-氨基庚酸作為反應(yīng)產(chǎn)物。
[0210] 實(shí)施例3 :羧酸還原酶使用庚二酸作為底物并形成庚二酸半醛的酶活性
[0211] 將編碼HIS標(biāo)簽的序列添加至分別編碼SEQ ID N0:4和7的羧酸還原酶的來(lái)自 Segniliparus rugosus和 Segniliparus rotundus 的基因（參見圖 7)，使得可以生成N-末 端有HIS標(biāo)簽的羧酸還原酶。將每種經(jīng)修飾的基因與編碼有HIS標(biāo)簽的來(lái)自枯草芽孢桿菌 的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶一起（兩者都在T7啟動(dòng)子下）克隆入pET Duet表達(dá)載體中。 將每種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入BL21 [DE3]大腸桿菌宿主，并且于37°C在含有50mL LB培養(yǎng)基和抗 生素選擇壓力的250mL搖瓶培養(yǎng)物中在以230rpm搖動(dòng)的情況中培養(yǎng)所得的重組大腸桿菌 菌株。使用自身誘導(dǎo)培養(yǎng)基于37°C誘導(dǎo)每種培養(yǎng)物過(guò)夜。
[0212] 經(jīng)由離心收獲來(lái)自每種經(jīng)誘導(dǎo)的搖瓶培養(yǎng)物的團(tuán)粒。重選每個(gè)團(tuán)粒，并經(jīng)由超聲 處理裂解，并經(jīng)由離心分開細(xì)胞碎片與上清液。使用Ni-親和層析從上清液中純化羧酸還 原酶和磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，以10倍稀釋入50mM HEPES緩沖液（pH = 7. 5)中，并 經(jīng)由超濾濃縮。
[0213] 在緩沖液中一式三份實(shí)施酶活性測(cè)定法（即從庚二酸鹽至庚二酸半醛），所述緩 沖液由終濃度 50mM HEPES 緩沖液（pH = 7. 5)、2mM 庚二酸、10mM MgCl2、lmM ATP 和 ImM NADPH組成。通過(guò)添加純化的羧酸還原酶和磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶基因產(chǎn)物或空載體 對(duì)照至含有庚二酸的測(cè)定緩沖液?jiǎn)?dòng)每個(gè)酶活性測(cè)定反應(yīng)，然后于室溫溫育20分鐘。通過(guò) 于340nm的吸光度監(jiān)測(cè)NADPH的消耗。每種沒有庚二酸的僅酶對(duì)照表明NADPH的低基線消 耗。參見圖9。
[0214] SEQ ID N0 4和SEQ ID N0 7的基因產(chǎn)物（得到sfp的基因產(chǎn)物增強(qiáng)）接受庚二 酸作為底物，如相對(duì)于空載體對(duì)照確認(rèn)的（參見圖10)，并且合成庚二酸半醛。
[0215] 實(shí)施例4 :羧酸還原酶使用7-羥基庚酸作為底物并形成7-羥基庚醛的酶活性
[0216] 將編碼His標(biāo)簽的序列添加至分別編碼SEQIDN0:2-7的羧酸還原酶的來(lái)自 海分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、Segniliparus rugosus、恥垢分枝桿菌、馬賽分枝桿菌、和 Segniliparus rotundus的基因（參見圖7)，使得可以生成N-末端有HIS標(biāo)簽的羧酸還原 酶。將每種經(jīng)修飾的基因與編碼有His標(biāo)簽的來(lái)自枯草芽孢桿菌的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn) 移酶一起（兩者都在T7啟動(dòng)子下）克隆入pETDuet表達(dá)載體中。
[0217] 將每種表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入BL21 [DE3]大腸桿菌宿主中，并于37°C在含有50mL LB培 養(yǎng)基和抗生素選擇壓力的250mL搖瓶培養(yǎng)物中在以230rpm搖動(dòng)的情況中培養(yǎng)所得的重組 大腸桿菌菌株。使用自身誘導(dǎo)培養(yǎng)基于37°C誘導(dǎo)每種培養(yǎng)物過(guò)夜。
[0218] 經(jīng)由離心收獲來(lái)自每種經(jīng)誘導(dǎo)的搖瓶培養(yǎng)物的團(tuán)粒。重選每個(gè)團(tuán)粒，并經(jīng)由超聲 處理裂解。經(jīng)由離心分開細(xì)胞碎片與上清液。使用Ni-親和層析從上清液中純化羧酸還原 酶和磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，以10倍稀釋入50mM HEPES緩沖液（pH = 7. 5)中，并經(jīng) 由超濾濃縮。
[0219] 在緩沖液中一式三份實(shí)施酶活性測(cè)定法（即從7-羥基庚酸至7-羥基庚醛），所述 緩沖液由終濃度50mM HEPES緩沖液（pH = 7. 5)、2mM 7-羥基庚醛、10mM MgCl2、ImM ATP和 ImM NADPH組成。通過(guò)添加純化的羧酸還原酶和磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶或空載體對(duì)照 至含有7-羥基庚酸的測(cè)定緩沖液?jiǎn)?dòng)每個(gè)酶活性測(cè)定反應(yīng)，然后于室溫溫育20分鐘。通 過(guò)于340nm的吸光度監(jiān)測(cè)NADPH的消耗。每種沒有7-羥基庚酸的僅酶對(duì)照表明NADPH的 低基線消耗。參見圖9。
[0220] SEQ ID N0 2-7的基因產(chǎn)物（得到sfp的基因產(chǎn)物增強(qiáng)）接受7-羥基庚酸作為底 物，如相對(duì)于空載體對(duì)照確認(rèn)的（參見圖11)，并且合成7-羥基庚醛。
[0221] 實(shí)施例5 : c〇-轉(zhuǎn)氨酶對(duì)于7-氨基庚醇形成7-氧代庚醇的酶活性
[0222] 將編