一種重組人表皮生長因子的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域，涉及一種重組人表皮生長因子（rhEGF)的純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人表皮生長因子（hEGF)由Cohen等人于1975年從人體尿液中分離得到，由于其可 抑制胃酸分泌，又被稱為抑胃素（Urogastrone)，是由53個(gè)氨基酸組成的小分子多肽。hEGF 通過與EGF受體（EGFR)結(jié)合，使EGFR二聚并激活細(xì)胞通路，發(fā)揮多種生物學(xué)功能，如促進(jìn) 細(xì)胞分裂，修復(fù)表皮損傷、胃腸潰瘍、角膜損傷；防治皮膚衰老，發(fā)揮美白嫩膚功效；靶向結(jié) 合含高密度EGFR受體的腫瘤組織，抑制癌細(xì)胞生長等。鑒于Cohen在EGF等方面的開拓性 工作及EGF本身重要的生物學(xué)作用，他與Montabcini于1986年榮獲諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)。
[0003] EGF在多種疾?。ㄈ缃悄p傷和糖尿病足等）的治療中體現(xiàn)出顯著的效果，其藥用 開發(fā)具有巨大的潛力；同時(shí)，EGF在美容方面的功效已被消費(fèi)者廣泛認(rèn)可，相關(guān)產(chǎn)品的市場 需求日益增大。然而，天然提取高活性EGF售價(jià)近200萬美元/克，提取效率極低，無法大 規(guī)模工業(yè)化制備，高質(zhì)量EGF原料的生產(chǎn)供應(yīng)遠(yuǎn)不能滿足市場需求，這嚴(yán)重制約了 EGF在醫(yī) 藥和化妝品方面的應(yīng)用。因此，開發(fā)一種高效的EGF生產(chǎn)工藝不僅具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也 為EGF進(jìn)一步應(yīng)用開發(fā)提供了最基本的保障。
[0004] EGF含有3對(duì)二硫鍵，很難通過化學(xué)合成法大量制備，現(xiàn)只能通過基因工程手段大 規(guī)模重組制備。為促進(jìn)二硫鍵的正確配對(duì)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，重組EGF (rEGF)制備主要以 融合表達(dá)為主：將EGF與可幫助蛋白正確折疊的伴侶蛋白和/或純化標(biāo)簽融合表達(dá)，并經(jīng)融 合蛋白純化、酶切、目的蛋白（EGF)純化等步驟制備，涉及的純化方法主要針對(duì)融合蛋白，酶 切后EGF純化僅需去除伴侶蛋白，與常規(guī)非融合EGF純化工藝差異較大，且酶切后EGF蛋白 仍含有殘留酶切標(biāo)簽，影響活性及安全性。中國專利201310651408. 0公布了將EGF與SUMO 蛋白和HIS標(biāo)簽融合后利用CHO細(xì)胞重組制備的工藝，但未提及酶切后EGF純化方法；中國 專利200810211603. 0公布了在EGF C末端增加 HIS標(biāo)簽并與PDI蛋白融合后利用大腸桿 菌重組表達(dá)，酶切后基于EGF結(jié)構(gòu)仍殘留的HIS標(biāo)簽利用鎳離子親和柱去除PDI伴侶蛋白， 純化后EGF結(jié)構(gòu)（EGF+HIS標(biāo)簽+酶切標(biāo)簽）與天然EGF差異性較大，存在安全性隱患。
[0005] 鑒于融合制備繁瑣的工藝步驟，部分研究者研發(fā)了 EGF非融合重組制備方法，該 部分研究主要以大腸桿菌原核制備為主。中國專利201210189605. 0和200510025289. 3 分別公布了 EGF在大腸桿菌分泌表達(dá)制備的方法，純化步驟包括超濾、疏水層析、凝膠層析 和離子交換層析，其中涉及的凝膠層析因上樣量所限、無法大規(guī)模放大；上述原核制備的 hEGF純品生物學(xué)活性分別為1. 13X IO6IlVmg和1. 21 X IO6 IU/mg，僅為已上市重組人表皮 生長因子（rhEGF)滴眼液（易貝，國藥準(zhǔn)字S20020016,標(biāo)示規(guī)格為：20000IU(40yg) :2ml， 即其比活性為5. OX 106IU/mg)活性的20-25%。
[0006] 酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速的真核表達(dá)系統(tǒng)，不僅具有原核生物生長快、操 作簡便的特點(diǎn)，還具備哺乳動(dòng)物細(xì)胞的翻譯后加工和修飾功能、可表達(dá)具有生物活性的外 源蛋白，尤其適合表達(dá)含多對(duì)二硫鍵的真核蛋白。同時(shí)，酵母菌可將目的蛋白通過一定的途 徑分泌到細(xì)胞外，大幅減少了目的蛋白的純化工藝及制備成本。中國專利97115284. 5公布 了利用甲基營養(yǎng)型酵母菌重組制備hEGF截短異構(gòu)體一一EGF (1-51)的方法，純化步驟包 括疏水層析、離子交換層析和凝膠層析，不利于工業(yè)化放大，且制備所得EGF (1-51)生物學(xué) 活性（I. 14X IO6IlVmg)較低。目前，尚未有工藝簡單、活性收率高、易于規(guī)模化放大生產(chǎn)的 高活性、高純度rhEGF制備工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供了一種rhEGF的純化方法，本發(fā)明具 有工藝簡便快速、步驟少、易于工業(yè)化放大等特點(diǎn)，純化產(chǎn)品活性、純度等多項(xiàng)指標(biāo)均高于 中國藥典要求，提高了后續(xù)使用的安全性、可控性和有效性。
[0008] 為達(dá)到上述的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種重組人表皮生長因子的純化方法，包括下述純化步驟： (1) Ni Sepharose親和層析：待Ni Sepharose層析柱用平衡緩沖液平衡后，將 pH7. 5-8. 5的含有rhEGF的培養(yǎng)液離心上清上樣，平衡緩沖液復(fù)平衡后，用含20mM咪唑的平 衡緩沖液洗脫目的蛋白； (2) Source 15RPC反相層析：待Source 15RPC反相層析柱用平衡緩沖液平衡后，將步 驟（1)目的蛋白洗脫液上樣，平衡緩沖液復(fù)平衡后，用洗脫液I洗脫雜質(zhì)蛋白，用洗脫液II 洗脫目的蛋白； (3) Source 30Q離子交換層析：待Source 30Q離子交換層析柱用平衡緩沖液平衡后， 將步驟（2)目的蛋白洗脫液上樣，平衡緩沖液復(fù)平衡后，用濃縮緩沖液洗脫，即得rhEGF原 液。
[0009] 所述的重組人表皮生長因子為酵母菌分泌表達(dá)。
[0010] 所述的步驟（1)- (3)中所用的平衡緩沖液為磷酸（PB)緩沖液或三羥甲基氨基甲 烷-鹽酸（Tris-HCl)緩沖液，緩沖濃度為10-50mmol/L，pH為7. 5-8. 5。
[0011] 優(yōu)選的是，步驟（1)- (3)中所用的平衡緩沖液為磷酸緩沖液，緩沖濃度為25mmol/ L，pH 為 8. 0。
[0012] 所述的步驟（2)中所用的洗脫液I為含25-35%乙腈的平衡緩沖液。
[0013] 優(yōu)選的是，步驟（2)中所用的洗脫液I為含33%乙腈的平衡緩沖液。
[0014] 所述的步驟（2)中所用的洗脫液II為含35-45%乙腈的平衡緩沖液。
[0015] 優(yōu)選的是，步驟（2)中所用的洗脫液II為含40%乙腈的平衡緩沖液。
[0016] 所述的步驟（3)中所用的濃縮緩沖液為PB緩沖液或甘氨酸-鹽酸（Gly-HCl)緩沖 液，緩沖濃度為 10-50mmol/L，pH 為 3. 0-4. 0。
[0017] 優(yōu)選的是，步驟（3)中所用的濃縮緩沖液為PB緩沖液，緩沖濃度為25mmol/L，pH 為 3· 5〇
[0018] 經(jīng)長時(shí)間高密度發(fā)酵，發(fā)酵液上清離子強(qiáng)度較高，且含有大量色素，影響rhEGF與 常規(guī)層析(如離子交換層析、疏水作用層析、反相層析)填料結(jié)合。酵母發(fā)酵上清純化前一般 需經(jīng)數(shù)小時(shí)的超濾除鹽除色素過程，然而，此過程極易引起羧肽酶對(duì)rhEGF C-末端的降解。 建立高效富集工藝是制備高活性rhEGF的關(guān)鍵。蛋白多肽組氨酸（HIS)殘基在特定情況下 可與鎳離子親和填料結(jié)合，此結(jié)合作用力受HIS數(shù)量及結(jié)構(gòu)影響。天然hEGF第10位和16 位氨基酸為HIS，本發(fā)明人研究后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵上清rhEGF在pH7. 5-8. 5可與Ni S印harose 6 Fast Flow填料有效結(jié)合，并在較低咪唑濃度完全洗脫，有效去除高濃度鹽離子和色素。
[0019] 為進(jìn)一步去除殘余色素及其他雜質(zhì)，將Ni Sepharose層析洗脫液進(jìn)一步進(jìn)行反相 層析純化。常規(guī)反相層析純化需在含三氟乙酸、高氯酸鈉等離子配對(duì)劑的強(qiáng)酸性條件下進(jìn) 行，極端PH及反復(fù)變化的緩沖條件會(huì)影響rhEGF結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。常規(guī)硅膠基質(zhì)反相層析介質(zhì) 僅能在酸性條件下使用，本發(fā)明采用的Source 15RPC反相層析介質(zhì)為聚苯乙稀/二乙烯基 苯，可在堿性條件下長期穩(wěn)定使用，比硅膠介質(zhì)載量高、流速快，更適合生產(chǎn)放大。所述的步 驟（2)采用與上步Ni Sepharose親和層析相同的pH和緩沖液，經(jīng)不同濃度乙腈分步洗脫， 可實(shí)現(xiàn)高純度rhEGF的層析制備。此步驟采用階段梯度洗脫，而非線性梯度洗脫，保證了大 規(guī)模工藝放大的易操作性。
[0020] 為去除殘余有機(jī)溶劑，并使蛋白緩沖條件與原液緩沖液完全一致，反相層析洗脫 液繼續(xù)進(jìn)行離子交換層析。所述的步驟（3)S 〇Urce 30Q離子交換層析采用與（1)和（2)完全 相同的平衡緩沖液，利用PH梯度洗脫而非常規(guī)離子強(qiáng)度梯度洗脫，使rhEGF洗脫液緩沖條 件與原液緩沖液完全相同，且避免了后續(xù)超濾或透析等除鹽操作。本發(fā)明采用Source 30Q 層析介質(zhì)的載量遠(yuǎn)高于 Q Sepharose Fast Flow、Q Sepharose High Performance、Mono Q、 Macrocap Q等介質(zhì)，使得本步驟可獲得高濃度rhEGF原液，利于儲(chǔ)存及后續(xù)分裝。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下突出的技術(shù)效果： ① 創(chuàng)造性的采用鎳離子親和層析純化不含HIS純化標(biāo)簽的天然結(jié)構(gòu)rhEGF蛋白，高效 捕捉酵母分泌表達(dá)上清中的rhEGF，并有效去除發(fā)酵上清的鹽離子及色素； ② 經(jīng)本發(fā)明三步純化后，rhEGF蛋白純度可達(dá)到98%以上，比活性高于5. OX 106IU/mg， 完全超越藥典標(biāo)準(zhǔn)要求，具有極高的實(shí)用價(jià)值； ③ 純化工藝中緩沖液pH始終保持一致，工藝過程不跨越目的蛋白等電點(diǎn)，有利于 rhEGF蛋白保持穩(wěn)定； ④ 工藝過程步驟少，操作簡便，不需特殊試劑，且不含有凝膠層析、透析、線性梯度洗脫 等不易放大的工藝步驟或操作，利于大規(guī)模工藝放大。
【附圖說明】
[0022] 附圖1 :純化后rhEGF蛋白SDS-PAGE電泳圖譜； 附圖2 :純化后rhEGF蛋白R(shí)P-HPLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下對(duì)本發(fā)明的特點(diǎn)進(jìn)行描述，所舉實(shí)施例僅為說明目的而并不旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn) 行限制。
[0024] 實(shí)施例1. rhEGF蛋白的純化 收集含rhEGF蛋白的培養(yǎng)液上清（lOOOmL)，用lmo