l/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8. 0,離心 去除不溶性雜質(zhì)，收集上清液。
[0025] 取Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析介質(zhì)，裝入常壓層析柱，用平衡緩沖液 (25mmol/L PB緩沖液，pH8. 0)以150cm/h流速(上樣和洗脫速度與平衡速度相同，下同)平衡 3個柱體積后，將含rhEGF的離心上清液上樣，用平衡緩沖液（25mmol/L PB緩沖液，pH8. 0) 復(fù)平衡，檢測Aafflnni，穿透峰棄去，待Aafflnni降至基線后，用含20mM咪唑的平衡緩沖液（25mmol/ L PB緩沖液，pH8. 0)洗脫，收集含rhEGF蛋白的洗脫峰； 取Source 15RPC反相層析介質(zhì)，裝入中高壓層析柱，用平衡緩沖液（25mmol/L PB緩沖 液，pH8. 0)以300cm/h流速平衡3個柱體積后，將rhEGF Ni S印harose洗脫樣品上樣，用 平衡緩沖液（25mmol/L PB緩沖液，pH8. 0)復(fù)平衡，檢測A214nni，穿透峰棄去，待A214nni降至基 線后，用含33%乙腈的平衡緩沖液洗脫雜質(zhì)，用含40%乙腈的平衡緩沖液洗脫，收集含rhEGF 蛋白的洗脫峰； 取Source 30Q離子交換層析介質(zhì)，裝入中高壓層析柱，用平衡緩沖液（25mmol/L PB緩 沖液，PH8. 0)以300cm/h流速平衡3個柱體積后，將rhEGF Source 15RPC洗脫樣品上樣，用 平衡緩沖液（25mmol/L PB緩沖液，pH8. 0)復(fù)平衡，檢測A214nni，穿透峰棄去，待A214nni降至基 線后且殘留乙腈完全去除后（可用氣相色譜監(jiān)控)，用濃縮緩沖液（25mM PB緩沖液，pH3. 5) 洗脫，收集含rhEGF蛋白的洗脫峰，即得高濃度rhEGF原液。
[0026] 實施例2. rhEGF蛋白SDS-PAGE純度測定 (1) 15%的分離膠配置 雙蒸水：3.3 mL;1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8) :2.5 mL;10%SDS:100 yL;30% 丙烯 酰胺單體貯液：4. 0 mL ;TEMED :4 μ L ;10%過硫酸銨：100 μ L ;總體積：10 mL?；靹蚝蠹尤?電泳槽的玻璃板夾縫中，并在膠面上加入約Icm雙蒸水，待膠自然凝聚后，除凈雙蒸水，并 在夾縫中放入梳子。
[0027] (2 ) 5%的濃縮膠配置 雙蒸水：3. 4 mL ;lmol/L Tris-HCl (ρΗ6· 8) :0· 63 mL ;10% SDS :50 yL ;30%丙烯酰胺 單體貯液：〇. 83mL;TEMED:5 yL;10%過硫酸銨：150 yL;總體積：5mL。混勻后，加入夾 縫中并沒過梳孔，待凝聚后小心拔出梳子，用電泳緩沖液沖洗加樣孔，清除未凝聚的丙稀酰 胺。
[0028] (3)溶液配置 ①電泳緩沖液（10X):稱取Tris 3.0 g，甘氨酸14. 4g，SDS 1.0 g，加適量的超純水 溶解，用HCl調(diào)pH至8. 3,加超純水定容至1 000 mL。
[0029] ②供試品緩沖液（4X):稱取Tris 0. 303g、溴酚藍(lán)2mg、SDS 0.8g，量取鹽酸 0. 189mL、甘油4mL，加水溶解并稀釋至10mL，使用前按體積比加入終濃度5%的β -巰基乙 醇，即得。
[0030] ③考馬斯亮藍(lán)染色液稱取考馬斯亮藍(lán)R250 lg，加入甲醇200mL、冰醋酸50mL、 水250mL混勻，即得。
[0031] ④考馬斯亮藍(lán)脫色液取甲醇400mL、冰醋酸IOOmL與水500mL混勻，即得。
[0032] (4)樣品制備 將rhEGF樣品分別與4X凝膠樣品緩沖液3:1混勾，在100°C沸水中保溫4-5 min，取 出待用。
[0033] (5)樣品測定 將樣品及標(biāo)準(zhǔn)蛋白加入點樣孔后，接通電源，恒壓電泳至溴酚藍(lán)到離底部約〇. 5 cm時， 停止電泳。將分離膠從玻璃板上取下，在染色液中染色1-2 h，脫色8 h，換保存液保存。
[0034] 如附圖1所示，rhEGF樣品未見明顯雜質(zhì)條帶，SDS-PAGE純度99. 2%，高于中國藥 典規(guī)定的電泳法"人表皮生長因子純度應(yīng)不低于95. 0%"的標(biāo)準(zhǔn)。
[0035] 實施例3. rhEGF RP-HPLC純度測定 儀器：Aglient 1100 HPLC;色譜柱：Welch Ultimate XB-C18(5ym 4.6X100mm);流動 相：A液為0. 1%三氟乙酸+水溶液；B液為0. 1%三氟乙酸+乙腈溶液；流速：I. 0 mL/min ; 洗脫方式：0-30min，B從5-95% ;檢測波長：220nm。取10 μ L rhEGF樣品，按上述條件進行 全梯度RP-HPLC純度測定。
[0036] 如附圖2所示，rhEGF樣品RP-HPLC圖譜未見明顯雜質(zhì)條帶，主峰RP-HPLC純度為 99. 3%，高于中國藥典規(guī)定的高效液相色譜法"人表皮生長因子主峰面積應(yīng)不低于總面積的 95. 0%"的標(biāo)準(zhǔn)。
[0037] 實施例4. hEGF生物活性測定(細(xì)胞增殖法/MTT比色法） (1)試劑配制 RPMI 1640培養(yǎng)液：RPMI 1640培養(yǎng)基粉末1袋(規(guī)格為1L)，加水溶解并稀釋到 1000ml，加青霉素 IO5U和鏈霉素 IO5IU,再加碳酸氫鈉2. lg，溶解后，混勻，除菌過濾，4°C保 存。
[0038] 維持培養(yǎng)液：量取新生牛血清4ml，加 RPMI 1640培養(yǎng)液到1000 ml。 完全培養(yǎng)液：量取新生牛血清l〇〇ml，加 RPMI 1640培養(yǎng)液到1000ml。 PBS :量取氯化鈉8g、氯化鉀0. 2g、磷酸氫二鈉 I. 44g、磷酸二氫鉀0. 24g，加水溶解并稀 釋到1000 ml的溶液，經(jīng)121°C，15分鐘滅菌。
[0039] 噻唑藍(lán)（MTT)溶液：取MTT粉末0· 10g，加 PBS20ml使溶解，經(jīng)0· 22um濾膜過濾除 菌。4°C避光保存。
[0040] (2 )標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取重組人表皮生長因子標(biāo)準(zhǔn)品按說明書復(fù)溶后，用維持培養(yǎng)液稀釋至每1ml含50 IU。 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，做4倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個濃度做2個孔。以上操作在無 菌條件下進行。
[0041] (3)供試品溶液的制備 將供試品按標(biāo)示量復(fù)溶后，用維持培養(yǎng)液稀釋成每1ml約含50 IU。在96孔板中，做4 倍系列稀釋，共8個稀釋度，每個濃度做2個孔。以上操作在無菌條件下進行。
[0042] (4)測定法 Balb/c3T3細(xì)胞株用完全培養(yǎng)液于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)，控制細(xì)胞濃度為每1ml含 1.0 X 105-5. OX IO6個細(xì)胞，傳代后24-36小時用于生物學(xué)活性測定。棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng) 液，消化和收集細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液配成每1ml含5. 0 X 104-8. 0 X IO4個細(xì)胞的細(xì)胞懸液， 接種于96孔板中，每孔IOOul，于37°C、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。24小時后換成維持培養(yǎng) 液，于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)24小時。制備的細(xì)胞培養(yǎng)板棄去維持液，加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液和 供試品溶液，每孔l〇〇ul，于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)64-72小時。每孔加入MTT溶液20ul， 于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)5小時。以上操作在無菌條件下進行。棄去培養(yǎng)板中的液體后， 向每孔中加入DMSO IOOul，混勻后在酶標(biāo)儀上，以630nm為參比波長，570nm處測定吸光度， 記錄測定結(jié)果。
[0043] 試驗數(shù)據(jù)采用計算機程序或四參數(shù)回歸計算法進行處理。并按下式計算結(jié)果：供 試品生物學(xué)活性（IU/ml) =Pr*Ds*Es/Dr*Er，式中Pr為標(biāo)準(zhǔn)品生物學(xué)活性，IU/ml ;Ds為供 試品預(yù)稀釋倍數(shù)；Dr為標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)稀釋倍數(shù)；Es為供試品相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品半效量的稀釋倍數(shù)； Er為標(biāo)準(zhǔn)半效稀釋倍數(shù)。
[0044] Balb/c3T3細(xì)胞活性測定結(jié)果顯示，本發(fā)明制備的hEGF原液比活性為 5. 5X 106IU/mg，高于中國藥典規(guī)定的按照細(xì)胞增殖法/MTT比色法"每Img蛋白應(yīng)不低于 5. 0X105IU" 的標(biāo)準(zhǔn)。
[0045] 實施例5. rhEGF蛋白的純化 收集含rhEGF蛋白的培養(yǎng)液上清（lOOOmL)，用lmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8. 0,離心 去除不溶性雜質(zhì)，收集上清液。
[0046] 取Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析介質(zhì)，裝入常壓層析柱，用平衡緩沖液 (25mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8. 0)以150cm/h流速平衡3個柱體積后，將含rhEGF的離 心上清液上樣，用平衡緩沖液（25mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8. 0)復(fù)平衡，檢測A280nni，穿 透峰棄去，待A2ifflnni降至基線后，用含20mM咪唑的平衡緩沖液（25mmol/L Tris-HCl緩沖液， PH8. 0)洗脫，收集含rhEGF蛋白的洗脫峰； 取Source 15RPC反相層析介質(zhì)，裝入中高壓層析柱，用平衡緩沖液（25mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8. 0)以300cm/h流速平衡3個柱體積后，將rhEGF Ni S印harose洗脫 樣品上樣，用平衡緩沖液（25mm〇l/LTris-HCl緩沖液，pH8. 0)復(fù)平衡，檢測A214nni，穿透峰棄 去，待A214nni降至基線后，用含33%乙腈的平衡緩沖液洗脫雜質(zhì)，用含40%乙腈的平衡緩沖液 洗脫，收集含rhEGF蛋白的洗脫峰； 取Source 30Q離子交換層析介質(zhì)，裝入中高壓層析柱，用平衡緩沖液（25mmol/ LTris-HCl緩沖液，pH8. 0)以300cm/h流速平衡3個柱體積后，將rhEGF Source 15RPC洗 脫樣品上樣，用平衡緩沖液（25mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH8. 0)復(fù)平衡，檢測A214nni，穿透峰 棄去，待A214nni降至基線后且殘留乙腈完全去除后(可用氣相色譜監(jiān)控)，用濃縮緩沖液（2