5mM Gly-HCl緩沖液，pH3. 5)洗脫，收集含rhEGF蛋白的洗脫峰，即得高濃度rhEGF原液。
[0047] rhEGF蛋白測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。
[0048] 實(shí)施例6. rhEGF蛋白的純化 收集含rhEGF蛋白的培養(yǎng)液上清（lOOOmL)，用lmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7. 5,離心 去除不溶性雜質(zhì)，收集上清液。
[0049] 取Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析介質(zhì)，裝入常壓層析柱，用平衡緩沖液 (lOmmol/L PB緩沖液，pH7. 5)以150cm/h流速平衡3個(gè)柱體積后，將含rhEGF的離心上清液 上樣，用平衡緩沖液（lOmmol/L PB緩沖液，pH7. 5)復(fù)平衡，檢測(cè)A280nni，穿透峰棄去，待Aafflnni 降至基線后，用含20mM咪唑的平衡緩沖液（lOmmol/L PB緩沖液，pH7. 5)洗脫，收集含rhEGF 蛋白的洗脫峰； 取Source 15RPC反相層析介質(zhì)，裝入中高壓層析柱，用平衡緩沖液（lOmmol/L PB緩沖 液，pH7. 5)以300cm/h流速平衡3個(gè)柱體積后，將rhEGF Ni S印harose洗脫樣品上樣，用 平衡緩沖液（lOmmol/L PB緩沖液，pH7. 5)復(fù)平衡，檢測(cè)A214nni，穿透峰棄去，待A214nni降至基 線后，用含25%乙腈的平衡緩沖液洗脫雜質(zhì)，用含35%乙腈的平衡緩沖液洗脫，收集含rhEGF 蛋白的洗脫峰； 取Source 30Q離子交換層析介質(zhì)，裝入中高壓層析柱，用平衡緩沖液（lOmmol/L PB緩 沖液，PH7. 5)以300cm/h流速平衡3個(gè)柱體積后，將rhEGF Source 15RPC洗脫樣品上樣，用 平衡緩沖液（lOmmol/L PB緩沖液，pH7. 5)復(fù)平衡，檢測(cè)A214nni，穿透峰棄去，待A214nni降至基 線后且殘留乙腈完全去除后（可用氣相色譜監(jiān)控)，用濃縮緩沖液（IOmM PB緩沖液，pH3.0) 洗脫，收集含rhEGF蛋白的洗脫峰，即得高濃度rhEGF原液。
[0050] rhEGF蛋白測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。
[0051] 實(shí)施例7. rhEGF蛋白的純化 收集含rhEGF蛋白的培養(yǎng)液上清（lOOOmL)，用lmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8. 5,離心 去除不溶性雜質(zhì)，收集上清液。
[0052] 取Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析介質(zhì)，裝入常壓層析柱，用平衡緩沖液 (50mmol/L PB緩沖液，pH8. 5)以150cm/h流速平衡3個(gè)柱體積后，將含rhEGF的離心上清液 上樣，用平衡緩沖液（50mmol/L PB緩沖液，pH8. 5)復(fù)平衡，檢測(cè)A280nni，穿透峰棄去，待A280nni 降至基線后，用含20mM咪唑的平衡緩沖液（50mmol/L PB緩沖液，pH8. 5)洗脫，收集含rhEGF 蛋白的洗脫峰； 取Source 15RPC反相層析介質(zhì)，裝入中高壓層析柱，用平衡緩沖液（50mmol/L PB緩沖 液，pH8. 5)以300cm/h流速平衡3個(gè)柱體積后，將rhEGF Ni S印harose洗脫樣品上樣，用 平衡緩沖液（50mmol/L PB緩沖液，pH8. 5)復(fù)平衡，檢測(cè)A214nni，穿透峰棄去，待A214nni降至基 線后，用含35%乙腈的平衡緩沖液洗脫雜質(zhì)，用含45%乙腈的平衡緩沖液洗脫，收集含rhEGF 蛋白的洗脫峰； 取Source 30Q離子交換層析介質(zhì)，裝入中高壓層析柱，用平衡緩沖液（50mmol/L PB緩 沖液，PH8. 5)以300cm/h流速平衡3個(gè)柱體積后，將rhEGF Source 15RPC洗脫樣品上樣，用 平衡緩沖液（50mmol/L PB緩沖液，pH8. 5)復(fù)平衡，檢測(cè)A214nni，穿透峰棄去，待A214nni降至基 線后且殘留乙腈完全去除后（可用氣相色譜監(jiān)控)，用濃縮緩沖液（50mM PB緩沖液，pH4. 5) 洗脫，收集含rhEGF蛋白的洗脫峰，即得高濃度rhEGF原液。
[0053] rhEGF蛋白測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。
[0054] 實(shí)施例8. rhEGF蛋白的純化 收集含rhEGF蛋白的培養(yǎng)液上清（2500mL)，用lmol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0,離心 去除不溶性雜質(zhì)，收集上清液。
[0055] 取Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析介質(zhì)，裝入常壓層析柱，用平衡緩沖液 (25mmol/L PB緩沖液，pH8. 0)以150cm/h流速平衡3個(gè)柱體積后，將含rhEGF的離心上清液 上樣，用平衡緩沖液（25mmol/L PB緩沖液，pH8. 0)復(fù)平衡，檢測(cè)A280nni，穿透峰棄去，待A280nni 降至基線后，用含20mM咪唑的平衡緩沖液（25mmol/L PB緩沖液，pH8. 0)洗脫，收集含rhEGF 蛋白的洗脫峰； 取Source 15RPC反相層析介質(zhì)，裝入中高壓層析柱，用平衡緩沖液（25mmol/L PB緩沖 液，pH8. 0)以300cm/h流速平衡3個(gè)柱體積后，將rhEGF Ni S印harose洗脫樣品上樣，用 平衡緩沖液（25mmol/L PB緩沖液，pH8. 0)復(fù)平衡，檢測(cè)A214nni，穿透峰棄去，待A214nni降至基 線后，用含33%乙腈的平衡緩沖液洗脫雜質(zhì)，用含40%乙腈的平衡緩沖液洗脫，收集含rhEGF 蛋白的洗脫峰； 取Source 30Q離子交換層析介質(zhì)，裝入中高壓層析柱，用平衡緩沖液（25mmol/L PB緩 沖液，PH8. 0)以300cm/h流速平衡3個(gè)柱體積后，將rhEGF Source 15RPC洗脫樣品上樣，用 平衡緩沖液（25mmol/L PB緩沖液，pH8. 0)復(fù)平衡，檢測(cè)A214nni，穿透峰棄去，待A214nni降至基 線后且殘留乙腈完全去除后（可用氣相色譜監(jiān)控)，用濃縮緩沖液（25mM PB緩沖液，pH3. 5) 洗脫，收集含rhEGF蛋白的洗脫峰，即得高濃度rhEGF原液。
[0056] rhEGF蛋白測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。
[0057] 本發(fā)明上述實(shí)施例1、5-8所得rhEGF蛋白，通過(guò)SDS-PAGE純度測(cè)定方法、RP-HPLC 純度測(cè)定方法、生物活性測(cè)定方法(細(xì)胞增殖法/MTT比色法）的結(jié)果見(jiàn)下表1。實(shí)施例5-8 所得rhEGF蛋白通過(guò)SDS-PAGE、RP-HPLC圖譜均未見(jiàn)明顯雜質(zhì)條帶。
[0058] 表1. rhEGF蛋白純化后結(jié)果
由于已經(jīng)根據(jù)以上實(shí)施例描述了本發(fā)明，任何等同替換對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都 是顯而易見(jiàn)的，且包含在本發(fā)明之中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組人表皮生長(zhǎng)因子的純化方法，其特征在于，包括下述純化步驟： (1) Ni Sepharose親和層析：待Ni Sepharose層析柱用平衡緩沖液平衡后，將 pH7. 5-8. 5的含有重組人表皮生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液離心上清上樣，平衡緩沖液復(fù)平衡后，用含 20mmol/L咪唑的平衡緩沖液洗脫目的蛋白； (2) Source 15RPC反相層析：待Source 15RPC反相層析柱用平衡緩沖液平衡后，將步 驟（1)目的蛋白洗脫液上樣，平衡緩沖液復(fù)平衡后，用洗脫液I洗脫雜質(zhì)蛋白，用洗脫液II 洗脫目的蛋白； (3) Source 30Q離子交換層析：待Source 30Q離子交換層析柱用平衡緩沖液平衡后， 將步驟（2)目的蛋白洗脫液上樣，平衡緩沖液復(fù)平衡后，用濃縮緩沖液洗脫，即得目的蛋白 原液。2. 如權(quán)利要求1所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子的純化方法，其特征在于：所述的重組人 表皮生長(zhǎng)因子為酵母菌分泌表達(dá)。3. 如權(quán)利要求1所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子的純化方法，其特征在于：步驟（1)- (3) 中所用的平衡緩沖液為磷酸緩沖液或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液，緩沖濃度為 10-50mmol/L，pH 為 7. 5-8. 5。4. 如權(quán)利要求3所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子的純化方法，其特征在于：步驟（1)-(3) 中所用的平衡緩沖液為磷酸緩沖液，緩沖濃度為25mmol/L，pH為8. 0。5. 如權(quán)利要求1所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子的純化方法，其特征在于：步驟（2)中所用 的洗脫液I為含25-35%乙腈的平衡緩沖液。6. 如權(quán)利要求5所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子的純化方法，其特征在于：步驟（2)中所用 的洗脫液I為含33%乙腈的平衡緩沖液。7. 如權(quán)利要求1所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子的純化方法，其特征在于：步驟（2)中所用 的洗脫液II為含35-45%乙腈的平衡緩沖液。8. 如權(quán)利要求7所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子的純化方法，其特征在于：步驟（2)中所用 的洗脫液II為含40%乙腈的平衡緩沖液。9. 如權(quán)利要求1所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子的純化方法，其特征在于：步驟（3)中 所用的濃縮緩沖液為PB緩沖液或甘氨酸-鹽酸緩沖液，緩沖濃度為10-50mmol/L，pH為 3. 0_4. 0〇10. 如權(quán)利要求9所述的重組人表皮生長(zhǎng)因子的純化方法，其特征在于：步驟（3)中所 用的濃縮緩沖液為PB緩沖液，緩沖濃度為25mmol/L，pH為3. 5。
【專利摘要】本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域，涉及了一種重組人表皮生長(zhǎng)因子（rhEGF）的純化方法，將含有rhEGF的離心上清液依次經(jīng)過(guò)Ni？Sepharose親和層析、Source？15RPC反相層析、Source30Q離子交換層析得到高活性、高純度的rhEGF蛋白。本發(fā)明創(chuàng)造性的采用Ni？Sepharose親和層析純化不含HIS純化標(biāo)簽的天然結(jié)構(gòu)重組人表皮生長(zhǎng)因子蛋白，具有工藝簡(jiǎn)單、活性收率高和易于規(guī)?；糯笊a(chǎn)等特點(diǎn)。
【IPC分類】C07K1/22, C07K1/18, C07K1/20, C07K14/485
【公開(kāi)號(hào)】CN105017407
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510488498
【發(fā)明人】張淳, 孟磊
【申請(qǐng)人】臨沂大學(xué), 山東仁瑞生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年8月11日...