小鼠肝臟特異性基因轉(zhuǎn)染方法、轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及小鼠肝臟特異性基因轉(zhuǎn)染方法以及轉(zhuǎn)基因人源化小 鼠模型的構(gòu)建方法，包括肝臟高效表達(dá)調(diào)控元件調(diào)控的肝臟特異性重組慢病毒載體構(gòu)建， 肝臟高效表達(dá)調(diào)控元件調(diào)控的重組慢病毒制備，通過水動力基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立的持續(xù)表達(dá) HCV入侵分子h⑶81和hOCLN并可被HCV自然感染的轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型的建立。本發(fā) 明涉及該模型在未來的抗HCV藥物篩選和疫苗評價中的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢病毒基因轉(zhuǎn)染法是以慢病毒作為載體的基因轉(zhuǎn)染方法。該技術(shù)作為一種常規(guī) 的基因轉(zhuǎn)染方法，可以將外源基因遞送到分裂期細(xì)胞或者不處于分裂期的細(xì)胞，通常被用 于基因治療或轉(zhuǎn)基因動物模型的建立。慢病毒載體系統(tǒng)是在人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV)基因組的基礎(chǔ)上改造而成。該載體系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒、包膜 質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)成，其中表達(dá)質(zhì)粒是慢病毒載體的核心質(zhì)粒。慢病毒載體系統(tǒng)相對于腺 病毒載體或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有不可比擬的優(yōu)勢，可穩(wěn)定整合于靶細(xì)胞基因組，實現(xiàn) 基因的持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。然而，該技術(shù)由于誘導(dǎo)宿主天然免疫反應(yīng)導(dǎo)致慢病毒的清除，從而造 成轉(zhuǎn)染失敗。
[0003] 水動力基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是一種簡便、高效的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染方法，近年來已有成熟發(fā) 展。它是在高壓下經(jīng)小鼠尾靜脈快速注射含目的基因重組質(zhì)粒的生理鹽水，從而在小鼠體 內(nèi)（主要在小鼠肝臟）實現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)，常用于動物實驗和實驗動物的造模。然 而，這種經(jīng)典的小鼠活體動物轉(zhuǎn)染技術(shù)也存在許多局限性，例如轉(zhuǎn)入的目的基因重組質(zhì)粒 在小鼠體內(nèi)存留時間短，不能整合到宿主染色體內(nèi)，從而無法實現(xiàn)基因的持續(xù)表達(dá)。然而， 該技術(shù)由于轉(zhuǎn)染時間短，不易誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型構(gòu)建方法（慢病毒基因轉(zhuǎn)染法和水動力基因 轉(zhuǎn)移技術(shù)）中轉(zhuǎn)染失敗和表達(dá)時間短等問題，本發(fā)明的目的聯(lián)合慢病毒基因轉(zhuǎn)染法和水動 力基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，提供一種在肝臟中特異、持續(xù)表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型構(gòu) 建方法。
[0005] 本發(fā)明所提供的基因轉(zhuǎn)染方法，是將大于IO5IFU攜帶有目的基因的重組慢病毒溶 解于相當(dāng)于小鼠體重8% -12%的生理鹽水中，以小于5秒的速度注于小鼠尾靜脈中，24小 時后目的基因在小鼠肝臟中獲得表達(dá)。
[0006] 在上述基因轉(zhuǎn)染方法中，所述攜帶有目的基因的重組慢病毒的注射量優(yōu)選為 IO6IFU,所述生理鹽水的注射量優(yōu)選為小鼠體重的10%，所述注射速度優(yōu)選為3秒，所述目 的基因的表達(dá)時間優(yōu)選為24小時以上。
[0007] 在上述基因轉(zhuǎn)染方法中，所述目的基因可以根據(jù)需要構(gòu)建的小鼠模型進(jìn)行選擇， 外源基因既可以是表達(dá)指示作用的報告基因，如螢火蟲熒光素酶基因，還可以是介導(dǎo)外源 病原體進(jìn)入肝細(xì)胞的分子編碼基因，如介導(dǎo)HCV進(jìn)入肝細(xì)胞的h⑶81和hOCLNcDNA。
[0008] 在上述基因轉(zhuǎn)染方法中，用于構(gòu)建攜帶有目的基因重組慢病毒質(zhì)粒的出發(fā)質(zhì)粒可 為任何一種表達(dá)外源基因的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，如以P⑶H-EFl-MCS-T2A-Puro為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu) 建的攜帶Fluc基因的重組表達(dá)質(zhì)粒為p⑶H-EFl-Fluc。
[0009] 所述的小鼠模型可根據(jù)需要構(gòu)建的小鼠模型進(jìn)行選擇，如成年鼠、新生鼠或乳鼠， 優(yōu)選6-8周齡的成年鼠。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0011] 1)攜帶目的基因的重組慢病毒載體構(gòu)建；
[0012] 2)重組慢病毒制備；
[0013] 3)將攜帶有目的基因的重組慢病毒溶解于相當(dāng)小鼠體重8% -12%的生理鹽水 中，以小于5秒的速度注于小鼠尾靜脈中，24小時后目的基因在小鼠肝臟中獲得表達(dá)，得到 轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
[0014] 其中目的基因、出發(fā)質(zhì)粒、小鼠類型均參考上述基因轉(zhuǎn)染方法的內(nèi)容。
[0015] 在肝臟特異性轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建中，所述目的基因為編碼介導(dǎo)HCV感染肝臟的 基因，具體可為肝臟特異性增強子和啟動子調(diào)控的h⑶81和hOCLN cDNA。
[0016] 具體肝臟特異性轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型的構(gòu)建，包含以下步驟：
[0017] (1)以P⑶H-EFl-MCS-T2A-Puro為出發(fā)載體構(gòu)建嵌合肝臟特異性增強子和啟動子 序列調(diào)控的慢病毒表達(dá)載體，命名為pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro ;
[0018] (? 將 hCDSl 和 hOCLN cDNA 插入 pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro 中，分別構(gòu)建重 組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒命名為 pCDH-AlbEhAATP-hCD81 和 pCDH-AlbEhAATP-OCLN ;
[0019] (3)將質(zhì)粒 pCDH-AlbEhAATP-hCD81 和 pCDH-AlbEhAATP-hOCLN 分別轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞 得到慢病毒；
[0020] (4)將h⑶81和hOCLN基因的慢病毒各IO5IFU,溶解于生理鹽水中，通過尾靜脈將 兩種混合病毒注入小鼠體內(nèi)，之后正常喂養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24h后得到肝臟中特異性表達(dá)hCDSl和 hOCLN分子的轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型。
[0021] 在肝臟中特異性表達(dá)h⑶81和hOCLN的轉(zhuǎn)基因小鼠模型也屬于本發(fā)明。
[0022] 所述轉(zhuǎn)基因小鼠模在疫苗評價或抗HCV藥物篩選中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明。
[0023] 基于上述提供的基因轉(zhuǎn)染方法、轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建方法、小鼠人源化肝臟特異 性基因轉(zhuǎn)染方法，本發(fā)明聯(lián)合了慢病毒基因轉(zhuǎn)染技術(shù)和水動力基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將慢病毒基 因整合特性和水動力的肝臟特異轉(zhuǎn)染特性巧妙地結(jié)合在一起，通過該方法可以使外源性基 因特異性地在小鼠肝臟中表達(dá)，且驗證對肝臟組織所造成的損傷可在4天左右恢復(fù)。該方 法可實現(xiàn)包含人源基因的重組慢病毒質(zhì)粒在小鼠肝臟內(nèi)表達(dá)目的蛋白。該技術(shù)可用于HCV 感染小鼠模型的建立和HCV疫苗評價和抗HCV藥物篩選，例如，通過轉(zhuǎn)染介導(dǎo)HCV入侵靶細(xì) 胞的分子h⑶81和hOCLN cDNA到6~8周的Balb-C小鼠，可以建立持續(xù)表達(dá)HCV入侵分 子的轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型。用本發(fā)明的方法可以評價轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型的肝臟對嗜 肝性病原體的易感性改變，也是建立疾病動物模型的一種手段，應(yīng)用前景廣泛。
[0024] 下面結(jié)合具體實施對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0025] 圖1為重組慢病毒載體p⑶H-AlbEhAATP-Luc構(gòu)建示意圖
[0026] 圖2A和圖2B為活體熒光成像結(jié)果顯示慢病毒水動力法轉(zhuǎn)染重組慢病毒 PCDH-AlbEhAATP-Luc后不同時間點小鼠肝臟中螢火蟲熒光素酶的表達(dá)情況
[0027] 圖3A和圖3B為慢病毒水動力法轉(zhuǎn)染重組慢病毒p⑶H-AlbEhAATP-Luc后不同時 間點小鼠肝功能轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST的檢測結(jié)果
[0028] 圖4為重組慢病毒載體p⑶H-AlbEhAATP-h⑶81構(gòu)建示意圖
[0029] 圖5為重組慢病毒載體pCDH-AlbEhAATP-hOCLN構(gòu)建示意圖
[0030] 圖6顯示實時定量RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型肝臟中h⑶81和 hOCLNmRNA的轉(zhuǎn)錄
[0031] 圖7顯示免疫組化法檢測轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型肝臟中h⑶81 (A)和hOCLN(B)分 子的表達(dá)
[0032] 圖8顯示實時定量RT-PCR法檢測HCV陽性血清感染小鼠的肝臟中病毒核酸含量
[0033] 圖9顯示實時定量RT-PCR法檢測HCVcc感染小鼠的肝臟中病毒核酸含量
【具體實施方式】
[0034] 針對現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型構(gòu)建（慢病毒基因轉(zhuǎn)染法和水動力基因轉(zhuǎn)移 技術(shù)）分別存在轉(zhuǎn)染失敗和表達(dá)時間短的問題，本發(fā)明聯(lián)合慢病毒基因轉(zhuǎn)染法和水動力基 因轉(zhuǎn)移技術(shù)，提供一種在肝臟中特異、持續(xù)表達(dá)外源基因的