轉基因人源化小鼠模型構建方 法。實施例基于前述技術方案，是對技術方案的詳細說明，不應理解為對其的限制。實施例 中使用了具體的目的基因、出發(fā)載體及各種實驗材料以達到具體公開的目的，與其類似功 能的材料可以做等同替換，也屬于本發(fā)明公開內(nèi)容。
[0035] 下述實施例中所用方法如無特殊說明均未常規(guī)方法。實施例中PCR法擴增目的基 因所需引物見表1，RT-PCR法測定轉基因人源化小鼠模型中CD81和OCLN表達所需引物見 表2。
[0036] 表1:PCR法擴增目的基因所需引物
[0038] 表2: RT-PCR法測定轉基因人源化小鼠模型中CD81和OCLN表達所需引物
[0039]
[0040] 實施例1、慢病毒水動力基因轉染方法的建立
[0041] 該實施例以具有表達指示作用的報告基因螢火蟲熒光素酶基因作為外源基因的 代表，說明慢病毒水動力基因轉染方法的成功建立。
[0042] 一、重組慢病毒載體pCDH-AlbEhAATP-Luc的構建
[0043] 重組慢病毒表達載體pCDH-AlbEhAATP-Luc是將AlbEhAATP-Luc序列（序列表中 序列1)插入慢病毒載體pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro (購自SBI公司）的SpeI和NotI位點間 得到的載體。
[0044] 具體制備如下：
[0045] 以慢病毒質(zhì)粒pGL3(Pr〇mega公司）為模板，加入擴增目的基因的引物（見表 1)，PCR方法擴增螢火蟲熒光素酶（Luc)基因，經(jīng)XbaI和Not I雙酶切后插入慢病毒骨 架載體P⑶H-EFI-MCS-T2A-Puro的酶切位點之間，構建為重組慢病毒表達載體，命名為 pCDH-AlbEhAATP-Luc (見圖 1)。
[0046] 二、重組慢病毒的包裝和濃縮
[0047] 將質(zhì)粒p⑶H-AlbEhAATP-Luc利用脂質(zhì)體介導的方法轉入包裝細胞293FT，進行慢 病毒的包裝。收集轉染3天的細胞培養(yǎng)上清，33500rpm，4°C，離心2h超速離心，得到濃縮的 重組慢病毒。
[0048] 三、慢病毒水動力基因轉染方法的建立
[0049] 將步驟二中濃縮的重組慢病毒，選擇6~8周的雄性Balb-C小鼠5只（購自軍事 醫(yī)學科學院實驗動物中心），將IO 5IFU的病毒溶解于小鼠體重10%的生理鹽水中，以4秒 的速度注入小鼠尾靜脈中，分別在轉染后的3天，7天，15天和30天，按照150mg/Kg的用量 小鼠腹腔注射Fluc的作用底物D-Luciferin(購自Promega公司），5min后麻醉小鼠，置于 IVIS活體熒光成像儀進行監(jiān)測。通過活體成像技術可以觀測到小鼠腹部肝臟位置有強烈的 信號，結果如圖2A所示，螢火蟲熒光素酶表達量見圖2B。在轉染后的第2天和第4天分別 對小鼠進行尾靜脈取血，進行轉氨酶ALT和AST的測定，結果如圖3A和圖3B所示，表明在 轉染后的第四天小鼠肝功恢復到正常水平。
[0050] 如前所述，本實施例慢病毒水動力基因轉染，是將大于IO5IFU的重組慢病毒溶解 于相當于小鼠體重8-10%的生理鹽水中，以小于5秒的速度注射于小鼠尾靜脈中，3天后即 能檢測到目的基因在小鼠肝臟處獲得了表達。
[0051] 實施例2、慢病毒水動力基因轉染方法構建h⑶81和hOCLN的轉基因人源化小鼠模 型
[0052] 將實施例1建立的轉基因方法實際應用到生物醫(yī)學相關實踐當中，本實施例通過 該方法構建HCV感染的動物模型。
[0053] 一、重組慢病毒載體 PCDH-AlbEhAATP-hCD81 和 pCDH-AlbEhAATP-hOCLN 的構建
[0054] 重組慢病毒表達載體 PCDH-AlbEhAATP-hCD81 和 pCDH-AlbEhAATP-hOCLN 為分別將 AlbEhAATP-hCD81(序列表中序列2)和AlbEhAATP-hOCLN(序列表中序列3)插入慢病毒載 體pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro (購自SBI公司）的SpeI和NotI位點間得到的載體。
[0055] 具體制備如下：
[0056] 分別以小鼠肝癌細胞H印al_6(呂麗萍，賈帥爭，王海平，詹林盛，王全立.人 LDLR基因的克隆及在H印al-6細胞中的表達.軍事醫(yī)學科學院院刊，2004 ;28:212-214) 和人肝癌細胞（Huh7. 5. 1)的DNA為模板，設計擴增目的基因的引物（表1)，使用PCR方 法擴增小鼠肝臟特異性白蛋白增強子序列（AlbE)和人肝臟特異性α-抗胰蛋白啟動子序 列（AATP)，平端連接后構建為嵌合肝臟特異性增強子序列和啟動子序列（In Vitro and in Vivo Comparative Study of Chimeric Liver-Specific Promoters)，經(jīng) SpeI 和 XbaI 雙酶切后插入處理好的慢病毒骨架載體pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro (購自SBI公司）的酶 切位點之間，構建為嵌合肝臟特異性增強子和啟動子序列調(diào)控的慢病毒表達載體，命名為 pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro。
[0057] 設計擴增目的基因的引物（表1)，利用TRIzol (Promega)從QSG 7701細胞 (肝內(nèi)皮細胞系，呂剛萍等，Hepatocytes transduced with human TERT gene acquire a prolonged lifespan in culture and retain permissiveness to hepatitis B virus.Acta virologica，2013 ;57:305-311)進行總 RNA 的提取，以提取的 RNA 為模板， Oligod⑴15為引物，進行反轉錄PCR，以合成的cDNA為模板，分別加入擴增目的基因（hCD81 或hOCLN)的特異性引物進行PCR擴增。擴增h⑶81的反應程序為94°C 2min預變性后， 94°C 30sec, 58°C 30sec, 72°C 30sec, 35 個循環(huán)后，72°C 7min。擴增 hOCLN 的反應程序為 94°C 2min 預變性后，94°C 30sec, 58°C 30sec, 72°C I. 5min, 35 個循環(huán)后，72°C 7min。1%瓊 脂糖凝膠電泳后回收目的片斷，與T-Vector的連接后轉化，挑取陽性克隆進行序列測定。 測定結果顯示擴增的序列正確。挑取測序正確的克隆進行搖菌擴增，提取質(zhì)粒，利用限制性 內(nèi)切酶XbaI和NotI將目的片斷切下，插入pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro中，分別構建了 重組慢病毒表達載體 pCDH-AlbEhAATP-hCD81 (圖 4)和 pCDH-AlbEhAATP-hOCLN (圖 5)。
[0058] 二、重組慢病毒的包裝和濃縮
[0059] 將質(zhì)粒 PCDH-AlbEhAATP-hCD81 和 pCDH-AlbEhAATP-hOCLN 利用脂質(zhì)體介導的方法 分別轉入包裝細胞293FT，進行慢病毒的包裝。收集轉染3天的細胞培養(yǎng)上清，33500rpm， 4°C，離心2h超速離心，得到濃縮的慢病毒。
[0060] 三、慢病毒水動力基因轉染方法建立肝臟中特異性表達h⑶81和hOCLN分子的轉 基因人源化小鼠模型
[0061] 收集并濃縮帶有h⑶81和hOCLN基因的慢病毒各IO5IFU,溶解于相當于BALB/c小 鼠（6~8周，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心）體重10%的生理鹽水中，以4秒的速度 通過尾靜脈將兩種混合病毒注入小鼠體內(nèi)，之后正常喂養(yǎng)，24小時后目的基因在小鼠肝臟 中獲得表達，即能得到肝臟中特異性表達hCD81和hOCLN分子的轉基因人源化小鼠模型，該 模型可持續(xù)到轉染后的第14天仍保持穩(wěn)定。
[0062] 通過以下實驗確證肝臟中特異性表達h⑶81和hOCLN分子的轉基因人源化小鼠模 型的構建成功：
[0063] (1)轉染14天后，將小鼠