脫臼處死，取肝臟后加入液氮用組織碾磨器碾碎，利用 TRIzol法提取總RNA，實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)h⑶81和hOCLN mRNA的轉(zhuǎn)錄，各反應(yīng)成分的 加量為2 X SYBR Premix Ex Taq 10 μ 1 (大連TaKaRa公司），上下游引物（表2) 0· 5 μ 1 (內(nèi) 對(duì)照基因 GAPDH)，cDNA模板lul，ddH2028ul，反應(yīng)參數(shù)為：98°C預(yù)變性2min，95°C變性5sec， 56°C退火20sec，72°C延伸15sec，40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行熔鏈曲線分析，95°C 15sec，將實(shí)時(shí)定量 PCR產(chǎn)物從60°C緩慢而均勻地升溫至95°C，升溫時(shí)間為lOmin，定時(shí)讀取熒光值，由實(shí)時(shí)熒 光定量PCR儀自動(dòng)計(jì)算出各基因的表達(dá)水平并繪制出熔鏈曲線。定量RT-PCR結(jié)果如圖6。
[0064] (2)免疫組化法檢測(cè)h⑶81和hOCLN在小鼠肝臟中的表達(dá)。
[0065] 轉(zhuǎn)染14天后，將小鼠脫白處死，取出肝臟，固定24h以上。將固定后的組織精細(xì)取 材后，于4°C下脫水、透明，52°C低熔點(diǎn)石蠟浸蠟包埋制成蠟塊。切片機(jī)對(duì)蠟塊進(jìn)行連續(xù)切 片，厚度為4 μ m，貼于載玻片上，56°C烘箱內(nèi)烤干備用。免疫組化法采用SP法：制片后常規(guī) 二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行微波抗原修復(fù)，PBS洗片3次，每次5min， 放入濕盒中。0.3% H2O2孵育，室溫lOmin。PBS洗片3次，每次5min。正常血清（I :10)孵 育，室溫20min。除去多余血清滴加鼠抗人⑶81抗體（I :200) -抗（購(gòu)自Santa Cruz公 司）100 μ 1于切片上，4°C，12-16h。PBS洗3次，每次5min。滴加 HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG(購(gòu)自北京中杉金橋公司）100 μ 1于切片上，室溫30min。PBS洗3次，每次5min。DAB 顯色I(xiàn)Omin(購(gòu)自北京中杉金橋公司）。充分水洗，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢及顯 微鏡攝影記錄結(jié)果。hOCLN的檢測(cè)步驟同上，兔抗人OCLN-抗（購(gòu)自Invitrogen)的孵育 濃度為1 :200。檢測(cè)結(jié)果如圖7,其中A幅箭頭指示hCD81陽(yáng)性的小鼠肝細(xì)胞（彩圖中棕色 著色部分），B幅箭頭指示hOCLN陽(yáng)性的小鼠肝細(xì)胞（彩圖中棕色著色部分）。
[0066] 實(shí)施例3、HCV感染的小鼠模型的建立及檢測(cè)
[0067] -、HCV Ib株感染的小鼠模型的建立及檢測(cè)
[0068] 將實(shí)施例2建立的轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型感染HCV Ib型血清，具體步驟為：實(shí)驗(yàn) 組和對(duì)照組各取5只BALB/c小鼠，實(shí)驗(yàn)組（transgenic mouse)和對(duì)照組（control)每只 小鼠經(jīng)尾靜脈注射約3X IO6IlVmL的HCV陽(yáng)性血清。在感染后的3、7和14天肝組織取材， 提取總RNA，實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)小鼠肝臟中HCV RNA，具體實(shí)驗(yàn)方法參照上?？迫A的 HCV實(shí)時(shí)定量試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行。檢測(cè)結(jié)果如圖8,顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中在接種HCV陽(yáng) 性血清后（inoculum)，在小鼠體內(nèi)均檢測(cè)到HCV RNA，但實(shí)驗(yàn)組要高于對(duì)照組，但3天后，實(shí) 驗(yàn)組HCV RNA有下降但維持低水平復(fù)制，對(duì)照組則下降到檢測(cè)水平以下。
[0069] 二、HCV 2a株感染的小鼠模型的建立及檢測(cè)
[0070] 將實(shí)施例2建立的轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型感染HCV 2a病毒液，具體步驟為：實(shí)驗(yàn) 組（transgenic mouse)和對(duì)照組（control)各取5只BALB/c小鼠，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每 只小鼠經(jīng)尾靜脈注射約2. 5 X 10sIU/mL的HCV 2a病毒液。在感染后的3、7和14天肝組織 取材，提取總RNA，實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)小鼠肝臟中HCV RNA，具體實(shí)驗(yàn)方法參照上?？?華的HCV實(shí)時(shí)定量實(shí)際盒使用說(shuō)明進(jìn)行。檢測(cè)結(jié)果如圖9,顯示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中在接種 HCVcc后（inoculum)，在小鼠體內(nèi)均檢測(cè)到HCV RNA，但實(shí)驗(yàn)組要高于對(duì)照組，但3天后，實(shí) 驗(yàn)組HCV RNA有下降但維持低水平復(fù)制，對(duì)照組則下降到檢測(cè)水平以下。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 以慢病毒基因轉(zhuǎn)染法和靜脈高壓注射轉(zhuǎn)染法為基礎(chǔ)的小鼠肝臟特異性基因轉(zhuǎn)染方 法，是將大于IO5IFU攜帶有目的基因的重組慢病毒溶解于相當(dāng)于小鼠體重8% -12%的生 理鹽水中，以小于5秒的速度注于小鼠尾靜脈中，24小時(shí)后目的基因在小鼠肝臟中獲得表 達(dá)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因轉(zhuǎn)染方法，所述攜帶有目的基因的重組慢病毒的注射量 優(yōu)選于IO6IFU,所述生理鹽水的注射量?jī)?yōu)選與于小鼠體重的10%，所述注射速度優(yōu)選于3 秒，所述目的基因的表達(dá)時(shí)間優(yōu)選于24小時(shí)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于，所述目的基因可以是根據(jù)需 要構(gòu)建的小鼠模型進(jìn)行選擇，外源基因既可以是表達(dá)指示作用的報(bào)告基因，如螢火蟲熒光 素酶基因，還可以是介導(dǎo)外源病原體進(jìn)入肝細(xì)胞的分子編碼基因，如介導(dǎo)HCV進(jìn)入肝細(xì)胞 的 hCD81 和 hOCLN cDNA。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于：用于構(gòu)建攜帶有 目的基因重組慢病毒質(zhì)粒的出發(fā)質(zhì)?？蔀槿魏我环N表達(dá)外源基因的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒； 以p⑶H-EFl-MCS-T2A-Puro為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建的攜帶Fluc基因的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為 pCDH-EFl-Fluc 〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的基因轉(zhuǎn)染方法，其特征在于，所述的小鼠可根據(jù)需 要構(gòu)建的小鼠模型（Balb-C或C57)進(jìn)行選擇，如成年鼠、新生鼠或乳鼠，優(yōu)選6-8周齡的成 年鼠。6. -種轉(zhuǎn)基因小鼠模型構(gòu)建方法，包括以下步驟： 1) 攜帶目的基因的重組慢病毒載體構(gòu)建； 2) 重組慢病毒制備； 3) 用權(quán)利要求1至5任一所述方法將所述重組慢病毒轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，得到轉(zhuǎn)基因小 鼠模型。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于：所述目的基因?yàn)?編碼介導(dǎo)HCV感染肝臟的基因，具體為h⑶81和hOCLN cDNA。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型的構(gòu)建方法，其特征在于：包含以下 步驟： (1) 以pCDH-EFl-MCS-T2A-Puro為出發(fā)載體構(gòu)建嵌合肝臟特異性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列 調(diào)控的慢病毒表達(dá)載體，命名為pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro ; (2) 將 hCD81 和 hOCLN cDNA 插入 pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro 中，分別構(gòu)建重組慢 病毒表達(dá)質(zhì)粒命名為 pCDH-AlbEhAATP-hCD81 和 pCDH-AlbEhAATP-OCLN ; (3) 將質(zhì)粒 pCDH-AlbEhAATP-hCD81 和 pCDH-AlbEhAATP-hOCLN 分別轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞得到 慢病毒； (4) 將h⑶81和hOCLN基因的慢病毒各IO5IFU,溶解于生理鹽水中，通過尾靜脈將兩種 混合病毒注入小鼠體內(nèi)，之后正常喂養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24h后得到肝臟中特異性表達(dá)hCD81和hOCLN 分子的轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型。9. 權(quán)利要求6或7或8所述方法構(gòu)建得到的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。10. 權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因小鼠模在疫苗評(píng)價(jià)或抗HCV藥物篩選中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以慢病毒基因轉(zhuǎn)染法和靜脈高壓注射轉(zhuǎn)染法為基礎(chǔ)的小鼠肝臟特異性基因轉(zhuǎn)染方法。該方法將慢病毒基因轉(zhuǎn)染法和靜脈高壓注射轉(zhuǎn)染法巧妙地結(jié)合在一起，通過該方法可以使外源基因特異性地在小鼠肝臟中表達(dá)，且對(duì)肝臟的損傷可在短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)。通過本轉(zhuǎn)染方法可在小鼠肝臟內(nèi)表達(dá)外源基因，該技術(shù)可以用于轉(zhuǎn)基因人源化小鼠模型的建立。用本發(fā)明的方法可以作為建立疾病動(dòng)物模型的一種手段。
【IPC分類】C12N15/867, A01K67/027
【公開號(hào)】CN105018526
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510424777
【發(fā)明人】呂麗萍, 許金波, 康瓊, 張艷宇, 馬平, 高博, 肖軍, 周錫鵬, 鄧江, 閆舫
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所
【公開日】2015年11月4日
【申請(qǐng)日】2015年7月17日