白溫度對冬棗多糖蛋白質(zhì)脫除率的影響如表一，酶法脫蛋白時間 對冬棗多糖蛋白質(zhì)脫除率影響如表二，木瓜蛋白酶加入量對冬棗多糖蛋白質(zhì)脫除率影響如 表三，酶解法脫蛋白正交試驗因素水平如表四，酶解法脫蛋白正交試驗因素水平結(jié)果如表 五，三氯乙酸量對蛋白質(zhì)脫除率及多糖蛋白質(zhì)脫除率的影響如表六。
[0044] 由表一可知，隨著溫度從40°C到60°C逐步升高，冬棗多糖蛋白質(zhì)脫除率逐漸減 小，故選擇最佳脫蛋白溫度為40°C。
[0045] 由表二可知，隨著脫蛋白時間的增加，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增加，到了 2h后開始變 小，從節(jié)約時間的角度考慮，最佳脫蛋白時間為1~2h。
[0046] 由表三可知，隨著木瓜蛋白酶加入量的增加，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增加，當加酶量 由150U/mL增加至300U/mL時，蛋白質(zhì)脫除率增加了 3. 00%，而當加酶量由300U/mL增加至 450U/mL蛋白質(zhì)脫除率增加了 1. 08%，從450U/mL之后蛋白質(zhì)脫除率增加的幅度較小，故選 擇木瓜蛋白酶最佳加入量為300U/mL~450U/mL。
[0047] 采用加權(quán)評分法，權(quán)重系數(shù)為0. 5,綜合評分=(蛋白質(zhì)脫除率/最大 值）X100X0. 5+ (多糖保留率/最大值）X100X0. 5。
[0048] 由表四和表五可知，影響冬棗多糖蛋白質(zhì)脫除率的先后順序為：酶解溫度 > 酶解 時間 > 加酶量，其中酶解溫度具有顯著效應；影響冬棗多糖保留率的先后順序為：加酶量 >酶解時間>酶解溫度，均無顯著效應。采用綜合加權(quán)法，最終確定木瓜蛋白酶脫蛋白的最 佳工藝為：加酶量為450U/mL，在40°C下酶解I. 5h，此時冬棗多糖蛋白質(zhì)脫除率為40. 99%， 多糖保留率為90. 19%。
[0049] 隨著三氯乙酸濃度的增加，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增加，同時多糖保留率逐漸減小，當 三氯乙酸濃度由7%增加至9%時，蛋白質(zhì)脫除率增加了 0. 843%，而多糖保留率幾乎不變，綜 合考慮蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率，確定三氯乙酸最佳脫蛋白濃度為9%。
[0050] 實施例4 一種從冬棗中分離、純化多糖的方法，包括以下步驟： (1)粗多糖的提?。簩⒑娓刹⒎鬯榈亩瑮椃勰凑斩瑮椃叟c水的質(zhì)量比為1:25,室溫 條件下浸泡30分鐘后，經(jīng)熱水浸提，得到粗多糖提取液和濾渣；將粗多糖提取液進行濃縮， 濃縮至原體積的1/4得濃縮液，向該濃縮液中加入質(zhì)量濃度95%的乙醇進行醇沉，加入乙醇 與濃縮液的體積比為2倍，醇沉8h，醇沉后進行離心，得冬棗粗多糖沉淀物，將所述冬棗粗 多糖沉淀物在60°C條件下真空干燥即得一次粗多糖。
[0051] (2)脫蛋白：將步驟（1)中制得的所述粗多糖配成體積濃度為1%的粗多糖溶液， 向所述粗多糖溶液中加入一定量的木瓜蛋白酶，其中，脫蛋白的酶解溫度為40°C，加酶量 為450U/mL、酶解時間為I. 5h;酶解后在沸水浴中滅酶15分鐘后自然冷卻，冷卻后加入濃 度為9%的三氯乙酸得一次混合溶液，將所述混合溶液置于4°C冰箱中靜置過夜，在轉(zhuǎn)速為 5000rpm/min條件下離心10分鐘，收集一次上清液備用，取上清液測定蛋白質(zhì)脫除率和多 糖保留率。
[0052] (3)脫色：將實施例1、實施例2和實施例3的步驟（2)中所述一次上清液用1%的 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值至7. 0后，加入1%活性炭得二次混合溶液，在溫度為40°C條件下脫 色40min，將脫色后的所述二次混合溶液在轉(zhuǎn)速為5000rpm/min條件下離心10分鐘，收集二 次上清液備用。
[0053] (4)過濾：將實施例1、實施例2和實施例3的步驟（3)中的所述二次上清液用 0. 45ym微孔濾膜過濾，過濾后真空干燥，得二次粗多糖。
[0054] (5)-次層析：采用DEAE-52纖維素柱進行一次層析，將步驟（4)中的二次粗多糖 上樣，依次用蒸餾水、〇? 2mol/L的NaCl、0. 3mol/L的NaCl和0? 5mol/L的NaCl進行分段洗 脫，流速為lmL/min，以每管5mL收集洗脫液，用苯酸-硫酸法于490nm處檢測，合并各吸收 的洗脫液，經(jīng)減壓濃縮裝入透析袋，在流水、蒸餾水中分別透析48h、24h后分別得多糖DPl 粗品和多糖DP2粗品，如圖1所不。
[0055] (6)二次層析：采用SephadexG-IOO凝膠色譜柱進行二次層析，分別將步驟（5)中 的多糖DPl粗品和多糖DP2粗品上樣，均用蒸餾水洗脫，濃縮、真空干燥后制得多糖DPl純 品和多糖DP2純品。
[0056] 理化性質(zhì)測定：實施例4中的步驟（6)中所述多糖DPl純品和所述多糖DP2純品 的濃度和分子量均測定采用凝膠色譜法測定，所述多糖DPl純品和所述多糖DP2純品的組 成、比旋度、糖醛酸含量分別采用糖腈乙酰酯化衍生-氣相色譜法、旋光儀測定和硫酸-咔 唑法測定。
[0057] -、冬棗多糖DPl和DP2組分純度和分子量測定采用凝膠色譜法： 將標準葡聚糖T10、T20、T40、T70、T500、DP1純品和DP2純品分別配成3mg/mL濃度，各 取ImL分別上SephadexG-IOO凝膠色譜柱（I. 6X40cm)，用蒸餾水洗脫，流速為0. 3mL/min， 以每管I. 5mL收集洗脫液，用苯酚-硫酸法逐管檢測，記錄不同相對分子質(zhì)量的多糖經(jīng)過凝 膠柱的洗脫體積（）和用藍色葡聚糖-2000上柱求得柱的外水體積（），以/為縱坐標，Ig為 橫坐標，計算曲線方程，并繪制冬棗多糖洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線判斷多糖純度是否均一。
[0058] 由標準葡聚糖的洗脫體積（）和藍色葡聚糖-2000外水體積（）及其分子量，得標 準曲線方程為/=-0. 59781gMw+6. 9012,R2=O. 9973,兩種冬棗多糖DPl和DP2的分子量分別 為I. 04X104Da、3. 02X105Da。
[0059] 如圖2和圖3所示，洗脫曲線中DP1和DP2峰形尖銳，對稱性好，說明其純度較高， 分子量分布較為均一。
[0060] 二、冬棗多糖純品DPl和DP2組成的測定： 2. 1、分別稱取IOmg多糖樣品DPI、DP2和標準單糖（鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、 葡萄糖、D-半乳糖)各加入3mL的2mol/L三氟乙酸，封管后IKTC下水解4h，待水解產(chǎn)物冷 卻至室溫，加入3mL甲醇，50°C氮吹濃縮至干，重復3次，盡量除盡三氟乙酸，得多糖水解產(chǎn) 物； 2. 2、水解產(chǎn)物中分別加入IOmg鹽酸羥胺，5mg肌醇，0. 5mL無水吡啶，混勻90°C水浴加 熱30min，取出，冷卻至室溫，加入0. 5mL無水乙肝，90°C水浴加熱30min，制得多糖樣品糖腈 乙?；a(chǎn)物，在氮吹儀上濃縮至干，加入I.OmL氯仿復溶，溶液經(jīng)0. 45ym濾膜過濾后進GC 分析。
[0061] 其中，氣相色譜條件為：SE-30毛細管柱（30mX0. 25mmX0. 25ym)，F(xiàn)ID檢測器， 氫氣體積流量為16mL/min，空氣體積流量150mL/min，氮氣體積流量20mL/min，進樣口溫度 230°C，檢測器溫度240°C，色譜柱采用程序升溫，起始溫度130°C，以5°C/min升至180°C/ min，保持 2min，再以 5°C/min升至 220°C/min，保持lOmin。
[0062] 三、冬棗多糖純品DPI和DP2比旋度測定： 將冬棗多糖DPl和DP2分別配制成lOmg/mL溶液，在20°C下用Idm的旋光管測定其旋 光度分別為：+20. 55°、+68. 01°。
[0063] 四、冬棗多糖純品DPl和DP2糖醛酸含量測定： 將冬棗多糖DP1、DP2配制成lmg/mL溶液，以半乳糖醛酸為對照，采用硫酸-咔唑法，在 523nm處測定吸光度