箱、電泳儀、凝膠 成像系統(tǒng)、滅菌鍋、分析天平、酸度計、光照培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、酶標儀、蛋白成像系統(tǒng)、電 轉儀、熒光顯微鏡等；
[0041] 藥品與試劑：
[0042]NaCl、NaOH、K2HPO4?3H20、KH2PO4'MgSO4?7H20、（NH4) 2S04、CaCl2?2H20、FeSO4?7H20、 MgCl2、NaAc、KAc、EDTA、CTAB、Tris、SDS、MES、Hindlll、SpeI、2XTaqPCRMasterMix、 DNAmaker、DNaseI、乙酰丁香酮、瓊脂糖、瓊脂粉、葡萄糖、尿素、乙醇、蛋白胨、酵母提取 物、RNAout試劑盒。聚乙烯吡咯烷酮（PVP40)、磺基水楊酸、NaN3、Na2S2O3、甲醛、異丙醇、冰 醋酸、三氯乙酸、甘油、丙烯酰胺、N，N' -亞甲雙丙烯酰胺、甘氨酸/過硫酸銨、麗春紅S、考 馬斯亮藍、溴酚藍、PMSF、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白預染Maker、脫脂奶粉、Tween-20、ECL發(fā) 光液和NC膜、Anti-6XHis-Tagantibody、羊抗兔HRP標記；
[0043] 實驗方法：
[0044] 試劑配制，
[0045]LB(LuriaBroth)培養(yǎng)基：10g蛋白胨（typtone)，5g酵母提取物（yeast extract)，IOgNaCl溶解于QSOmT,去離子水中，用lmol/LNaOH調節(jié)pH至 7. 0,10OOmT,容量 瓶定容，121°C，25min高壓除菌，4°C保存；
[0046]LB固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉1. 5%，頂培養(yǎng)基即誘導培養(yǎng)基：將下述2種溶液混勻 配成工作液，4°C保存，
[0047]頂培養(yǎng)基I(900mL):NaCl0? 15g，K2HPO4 ? 3H20 2. 7g，KH2PO4I. 45g，MgSO4 ? 7H20 0? 5g，（NH4)2SO4 0? 5g，加去離子水 800mL溶解，調PH至 5. 3,加水至 900mL，121°C，25min高 壓除菌；
[0048]頂培養(yǎng)基II(IOOmL) :CaCl2 ? 2H20 0? 067g，FeSO4 ? 7H20 0? 0025g，C6H12O6 2g，MES 8. 54g，甘油0. 5g，調pH至5. 3,0. 22ym針頭式過濾器過濾除菌；
[0049] 選擇固體培養(yǎng)基：量取90mLBG-Il培養(yǎng)基，加入Ig瓊脂粉，121°C，25min高壓 除菌，待其溫度降到 60°C左右，加入 10mL10XGlu+Urea、200yL100mg/mL的Amp200yL lOOmg/mL的Cef和200yL50mg/mL的Hyg，混勻，倒入培養(yǎng)皿，待其冷卻凝固，封口膜密封， 4°C保存；
[0050] 0.lmol/LCaCl2溶液：稱取CaCl2 ? 2H20I. 47g，溶于足量的去離子水，IOOmL容量 瓶定容，0. 22ym針頭式過濾器過濾除菌；
[0051]CaCl2-MgCl2溶液（80mmol/LMgCl2、20mmol/LCaCl2):稱取I. 63g，溶于足量的去 離子水中，加入0.lmol/LCaCl2溶液20mL，IOOmL容量瓶定容，0. 22ym針頭式過濾器過濾 除囷；
[0052] 0?lmol/LCaCl2溶液：稱取CaCl2?2H20I.47g，溶于足量的去離子水，IOOmL容量 瓶定容，0. 22ym針頭式過濾器過濾除菌；
[0053] 50%甘油：量取50mL甘油，加入50mL去離子水，混勻，121°C，25min高壓除菌，4°C 保存；
[0054]5mol/LNaCl溶液：稱取29.22gNaCl，加熱溶解于足量的去離子水，IOOmL容量瓶 定容，121°C，25min高壓除菌，室溫保存；
[0055] 3mol/LNaAc(pH5. 2):稱取NaAc24. 6g，溶于80mL去離子水中，加冰醋酸調PH至 5. 2,IOOmL容量瓶定容，121°C，25min高壓除菌，室溫保存；
[0056]lmol/LTirs-Hcl(pH8. 0):稱取Tirs12. 114g，溶于 80mL去離子水中，加濃鹽酸 調節(jié)pH至8. 0,IOOmL容量瓶定容，121°C，25min高壓除菌，室溫保存；
[0057] 5mol/LKAc(pH6. 0):稱取KAc49. 07g，溶于80mL去離子水中，加冰醋酸調PH至 6. 0,IOOmL容量瓶定容，121°C，25min高壓除菌，室溫保存；
[0058] 10mol/L NaOH:稱取40g NaOH，溶于80mL去離子水中，IOOmL容量瓶定容，室溫保 存；
[0059] 0? 5mol/LEDTA(pH8. 0):稱取EDTA-Na2 18. 16g，加 80mL去離子水，磁力攪拌器上 攪拌，慢慢加入l〇mol/LNaOH，調節(jié)PH至8. 0,IOOmL容量瓶定容，121°C，25min高壓除菌， 室溫保存；
[0060] 10%SDS:稱取SDSlOg，加熱溶解于足量去離子水中，IOOmL容量瓶定容，室溫保 存；
[0061]質粒提取溶液I=C6H12O6?H20lg，lmol/LTirs-Hcl(pH8. 0)2. 5mL，0. 5mol/ LEDTA(pH8. 0) 2mL，IOOmL容量瓶定容，121°C，25min高壓除菌，4°C保存；
[0062]質粒提取溶液II:10%SDS100yL，lOmol/LNaOH20yL，滅菌去離子水 880yL 制成ImL質粒提取溶液II，現用現配；
[0063] 質粒提取溶液III:5mol/LKAc(PH6. 0) 60mL，冰乙酸11. 5mL，滅菌去離子水 28. 5mL，配好后裝入一個滅菌的瓶子中，4°C保存；
[0064] 0. 15mol/LNaCl溶液：稱取0. 877gNaCl，溶于足量的去離子水，IOOmL容量瓶定 容，121°C，25min高壓除菌，4°C保存；
[0065] 0? 02mol/LCaCl2溶液：取滅菌的 15mL離心管，加入 0?lmol/LCaCl2溶液 2mL，再 加入8mL滅菌去離子水，混勻，4°C保存；
[0066]lOOmmol/LAS(乙酰丁香酮）：稱取196. 2mg乙酰丁香酮，溶于5mLDMS0,加去離子 水定溶于10mL，超凈臺中操作，所有器具都需滅菌，-20°C保存；CTAB提取液：稱取CTAB2g， 加入約 40mL去離子水中，加入lmol/LTirs-Hcl(PH8. 0) 10mL，0. 5mol/LEDTA(PH8. 0)4mL， 5mol/LNaCl溶液28mL，加熱使CTAB溶解，IOOmL容量瓶定容，121°C，25min高壓除菌，室溫 保存；
[0067]蛋白提取緩沖液I:10mmol/LTris-HCl(pH8. 0)加入 0? 020g/LNaN3以及 0.001g/LPMSF，
[0068]蛋白提取緩沖液2 :300mL去離子水中加入45mLlmol/LTris-HCl(pH8.0)溶液、 75mL甘油和，6g聚乙烯吡咯烷酮（PVP40)以及0. 001g/LPMSF
[0069] 30% (W/V)丙稀酰胺溶液：29g丙稀酰胺（Acrylamide)和IgN,N' -亞甲雙丙稀 酰胺溶于SOmL去離子水中，充分攪拌溶解，定容至100mL，0. 45ym膜過濾后置于棕色瓶中 4 °C保存待用；
[0070] 10% (W/V)過硫酸銨（AP) :0.Ig過硫酸銨溶于ImL去離子水中，4°C保存待用，有 效期為兩周；
[0071] 10% (W/V)SDS=IOgSDS溶于80mL去離子水，加熱溶解，定容至100mL，室溫保存；
[0072]I. 5mol/LTris-HCl(pH8. 8) :18. 17gTris溶于 80mL去離子水中，加入濃鹽酸調節(jié) PH至8. 8,定容至100mL，4°C保存待用；
[0073]lmol/LTris-HCl(pH6. 8) :12.IgTris溶于 80mL去離子水中，加入濃鹽酸調節(jié)PH 至6. 8,定容至100mL，4°C保存待用；
[0074] 5XTris-Glycinebuffer: 15.lgTris，94g甘氨酸，5gSDS，溶于HOOmT,去離子水 中，加熱并充分攪拌使其溶解，定容至lOOOmL，室溫保存；
[0075] 5XSDS-PAGELoadingbuffer:取 1.25mLlmol/LTris-HCl(pH6. 8)，0.5gSDS， 25mg溴酚藍，2. 5mL甘油，加去離子水溶解并定容至5mL，0. 5mL/份分裝，室溫保存，使用前 每份加入25yLP-巰基乙醇；
[0076] 考馬斯亮藍R-250染液：稱取Ig考馬斯亮藍R-250,加入250mL異丙醇，攪拌溶解， 加入IOOmL冰醋酸和650mL去離子水，充分攪拌，室溫保存；
[0077] 考染脫色液：冰醋酸100mL，乙醇50mL，去離子水850mL，充分攪拌后，室溫保存；
[0078] 甲酸固定液：40%甲醇、0? 5mL37%甲酸，
[0079]硫代硫酸鹽顯影液：3%Na2C03、0. 0004%Na2S203、0. 5mL/L37%福爾馬林，
[0080] 半干式電轉緩沖液：48mmol/LTris，39mmol/L甘氛酸（Glycine)，0? 04 %SDS， 20%甲醇；
[0081] 10X麗春紅染液：麗春紅S2g，三氯乙酸30g，磺基水楊酸30g，去離子水定容至 IOOmL，室溫保存；
[0082]TBST:lmol/LTris-HCl(pH7. 5) 10mL，加入 800mL去離子水，加入 8. 8gNaCl，加熱 攪拌溶解，定容至1000ml，最后加入使用前加入20 %TWeen20，TWeen20的終濃度為0? 05 %〇 [0083] 本發(fā)明的基因序列的優(yōu)化設計和表達載體的構建步驟為：
[0084] 1)先確定HuIFN-a2b基因序列；
[0085] 2)通過對HuIFN-a2b基因在普通小球藻中的密碼子使用頻率做一個分析，找出 小球藻使用頻率低的密碼子；
[0086]3)根據小球藻Rubisc蛋白，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶，對應氨基酸的密碼子將 小球藻使用頻率低的密碼子替換掉；
[0087] 4)在優(yōu)化的人干擾素HuIFN-a2b基因5'端加A，使其形成AfIIII限制性酶切位 點，在其3'去掉終止密碼子，添加SpeI的限制性酶切位點；
[0088] 5)將pCAMBIA1304 通過NcoI(ClCATGG)和SpeI(AlCT