HuIFN-a2b基因序列為人類基因序列，有些密碼子在小球藻中使用頻 率極低或不常使用，為了最大限度地提高在宿主小球藻中的基因表達(dá)效率，用小球藻的偏 好密碼進(jìn)行替換。找到小球藻使用頻率低的密碼子CTA、CAA、AGA、ATA、AAA、TTA ;Rubisc是 地球上最豐富的蛋白，是植物和小球藻中含量最多，表達(dá)量最高的蛋白之一；因此，用小球 藻Rubisc蛋白（核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶）對應(yīng)氨基酸的密碼子將小球藻使用頻率低 的密碼子替換掉，對比優(yōu)化前后序列差異性如圖1所示。
[0231] 人干擾素HuIFN-a2b基因的合成和表達(dá)載體的構(gòu)建：
[0232] 按照優(yōu)化后HuIFN-a2b基因人工合成該序列，兩端加AfIIII和SpeI酶切位點(diǎn)， 將PCAMBIA1304通過NcoI和SpeI雙酶切，人工合成序列構(gòu)建AflIII和SpeI雙酶切， 連接兩個片段構(gòu)建PCAMBIA1304-IFN表達(dá)載體，如圖2所示，測序確定該載體構(gòu)建正確。
[0233] 大腸桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定：
[0234] 挑取四個大腸桿菌轉(zhuǎn)化子提取重組質(zhì)粒，以IFN-1FP/IFN-1RP以及IFN-2FP/ IFN-2RP引物擴(kuò)增，結(jié)果可以看到重組質(zhì)?？梢詳U(kuò)增出498bp和321pb長的片段，可知這四 個大腸桿菌均為陽性轉(zhuǎn)化子，而且HuIFN-a2b基因已經(jīng)成功連入質(zhì)粒pCAMBIA1304,如圖3 所示；
[0235] 將大腸桿菌中提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行HindIII和SpeI雙酶切，可以看到經(jīng)過酶切 后，出現(xiàn)一條介于1000 bp和2000bp之間的條帶，靠近lOOObp，與重組質(zhì)粒兩個酶切位點(diǎn)之 間1262bp的距離一致，可知HuIFN-a2b基因已經(jīng)連入質(zhì)粒pCAMBIA1304對應(yīng)的位點(diǎn)，重組 質(zhì)粒連接正確；
[0236] 根癌農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定：
[0237] 挑取六個農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，以IFN-1FP/IFN-1RP以及IFN-2FP/IFN-2RP引 物擴(kuò)增，結(jié)果可以看到擴(kuò)增出498bp和321pb長的片段，可知這六個農(nóng)桿菌均為陽性轉(zhuǎn)化 子，可以作為轉(zhuǎn)化小球藻的工程菌，如如圖4所示；
[0238] 小球藻的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化體的篩選：
[0239] 將誘導(dǎo)培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌，含有PCAMBIA1304-IFN表達(dá)載體菌液與經(jīng)過處理的對數(shù) 期小球藻藻液混勻，裝入離心管中，25°C，黑暗共培養(yǎng)2天；2天后將共培養(yǎng)藻液均勻涂布于 選擇培養(yǎng)基上，28°C，生化培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)3天，然后光照培養(yǎng)，約2周后，選擇培養(yǎng)基上長 出少量藻落，獲得小球藻轉(zhuǎn)化體，而對照組則沒有藻落長出。
[0240] 小球藻轉(zhuǎn)化體的PCR鑒定，所述小球藻為蛋白核小球藻：
[0241] 為了驗(yàn)證小球藻轉(zhuǎn)化體的真實(shí)性，提取小球藻轉(zhuǎn)化體和野生型小球藻的基因組 DNA，以IFN-1FP/IFN-1RP以及IFN-2FP/IFN-2RP引物擴(kuò)增，結(jié)果轉(zhuǎn)基因小球藻DNA可以擴(kuò) 增出498bp和321pb長的片段，且與pCAMBIA1304-IFN質(zhì)粒擴(kuò)增出的片段長度相同，而野生 型的小球藻的DNA沒有相應(yīng)的條帶擴(kuò)增出來，可知HuIFN-a2b基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入小球藻。
[0242] 小球藻轉(zhuǎn)化體的RT-PCR鑒定：
[0243] 為了考察小球藻轉(zhuǎn)化體中人干擾素基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況，提取轉(zhuǎn)基因小 球藻和野生型小球藻的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以IFN-1FP/IFN-1RP以及IFN-2FP/ IFN-2RP引物擴(kuò)增，結(jié)果轉(zhuǎn)基因小球藻的cDNA可以擴(kuò)增出498bp和321pb長的片段，與 PCAMBIA1304-IFN質(zhì)粒擴(kuò)增出的片段長度相同，而野生型小球藻的cDNA沒有相應(yīng)的條帶擴(kuò) 增出來，可知HuIFN-a2b基因已經(jīng)在小球藻細(xì)胞內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄。
[0244] Western Blot檢測轉(zhuǎn)基因小球藻干擾素融合蛋白的表達(dá)：
[0245] 確定HuIFN-a2b基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入小球藻并可以成功轉(zhuǎn)錄后，要進(jìn)一步驗(yàn)證融合蛋 白的表達(dá)必須通過Westernblot，在融合蛋白的C端帶有6個組氨酸組成的His-tag，利用 該標(biāo)簽可以提取以及鑒定融合蛋白；
[0246] 用提取緩沖液1提取轉(zhuǎn)基因小球藻和野生型小球藻的總蛋白，WesternBlot檢測 C端帶有His-tag的融合蛋白，將100-130KDa之間的膜切下來，封閉，孵育一、二抗，然后顯 色，轉(zhuǎn)基因小球藻的膜上出現(xiàn)條帶而野生型小球藻對應(yīng)的位置沒有相應(yīng)的條帶顯現(xiàn)出來， 可知融合蛋白在轉(zhuǎn)基因小球藻中表達(dá)，如圖6所示；轉(zhuǎn)基因小球藻融合蛋白觀察：
[0247] 將轉(zhuǎn)基因小球藻與未轉(zhuǎn)基因的小球藻臨時玻片在熒光顯微鏡下觀察可看到轉(zhuǎn)基 因小球藻細(xì)胞有一部分呈現(xiàn)綠色熒光，而野生型小球藻則基本全部呈現(xiàn)由葉綠體發(fā)出的紅 色熒光，可見干擾素與綠色熒光蛋白的融合蛋白已經(jīng)在小球藻細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，可能由于 遺傳的不穩(wěn)定、外源蛋白表達(dá)量的差異或者表達(dá)的時空差異，轉(zhuǎn)基因小球藻也不是全部都 呈現(xiàn)綠色熒光；
[0248] 根據(jù)蛋白核小球藻對密碼子的偏好性，設(shè)計并合成適合蛋白核小球藻表達(dá)的 HuIFN-a2b基因序列，并連入pCAMBIA1304,挑取4個大腸桿菌轉(zhuǎn)化子提取重組質(zhì)粒，經(jīng)過 PCR和酶切鑒定，確認(rèn)重組質(zhì)粒pCAMBIA1304-IFN構(gòu)建成功。將pCAMBIA1304-IFN轉(zhuǎn)入根癌 農(nóng)桿菌AGL-I，挑取6個農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，確定其均為陽性轉(zhuǎn)化子，可作為工程菌 轉(zhuǎn)化小球藻。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小球藻轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒PCAMBIA1304-IFN中的 T-DNA區(qū)整合入小球藻的基因組DNA中，其中包括潮霉素抗性基因和HuIFN-a2b基因，潮霉 素抗性基因的表達(dá)使得轉(zhuǎn)基因小球藻可以含潮霉素的選擇培養(yǎng)基上生長，挑取3個選擇培 養(yǎng)基上的藻落除菌，在無選擇壓的培養(yǎng)基中生長后，繼續(xù)劃線于含潮霉素的選擇培養(yǎng)基上 讓其生長，結(jié)果只有一個藻株擁有較穩(wěn)定的潮霉素抗性。提取其基因組DNA和總RNA分別 進(jìn)行PCR和RT-PCR鑒定，確定HuIFN-a2b基因已經(jīng)成功整合入小球藻基因組DNA并且轉(zhuǎn) 錄成功；
[0249] 通過WesternBlot檢測融合蛋白的表達(dá)，由于融合蛋白的分子量大約為115KDa 左右，只要檢測100_130KDa之間是否有特異條帶即可確定融合蛋白的表達(dá)與否，最終顯示 結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小球藻顯出特異條帶而野生小球藻沒有，通過熒光顯微鏡觀察到部分轉(zhuǎn)基 因小球藻發(fā)出綠色熒光而，確定人干擾素HuIFN-a2b基因已經(jīng)在小球藻細(xì)胞內(nèi)成功翻譯 表達(dá)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用小球藻表達(dá)人干擾素基因的方法，以小球藻為生物材料，包括HuIFN-a 2b 基因序列，用小球藻的偏好密碼子對人干擾素HuIFN-a 2b基因序列進(jìn)優(yōu)化改造，其特征 是所述方法包括：1)利用小球藻的使用頻率高的偏好密碼子取代小球藻的使用頻率低的 密碼子，人工合成在小球藻中表達(dá)的人干擾素HuIFN- a 2b基因序列，并連入pCAMBIA1304 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒PCAMBIA1304-IFN，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌；2)用大腸桿菌轉(zhuǎn)化子提取重組質(zhì)粒 PCAMBIA1304-IFN，將所述重組質(zhì)粒pCAMBIA1304-IFN轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AGL-I ;3)利用根癌 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小球藻轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒PCAMBIA1304-IFN中的T-DNA區(qū)整合入小球藻 的基因組DNA中，使優(yōu)化改造的人干擾素HuIFN-a 2b基因整合到小球藻基因組中并表達(dá)。2. 依據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用小球藻表達(dá)人干擾素基因的方法，其特征是所述 1)步合成相應(yīng)的小球藻表達(dá)的人干擾素HuIFN-a 2b基因序列，方法如下：（1)用小球藻 R u b i s c蛋白對應(yīng)氨基酸的密碼子將小球藻使用頻率低的密碼子替換掉；（2)在優(yōu)化 的人干擾素HuIFN- a 2b基因5'端加A，使其形成Afl III限制性酶切位點(diǎn)，在其3'去掉 終止密碼子，添加SpeI的限制性酶切位點(diǎn)；（3)將pCAMBIA1304通過NcoI (ClCATGG) 和SpeI (AlCTAGT)雙酶切，人工合成人干擾素HuIFN-a 2b基因用AflIII(AlCATGT)和 SpeI (aIctagt)雙酶切，回收酶切片段，T4 DNA連接酶將粘性末端連接，制成重組質(zhì)粒 PCAMBIA1304-IFN 表達(dá)載體。3. 依據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用小球藻表達(dá)人干擾素基因的方法，其特征是所 述人干擾素HuIFN-a 2b基因序列的設(shè)計引物為： IFN-I FP^r ATGTGCGACCTTCCCCAGAC 3r IFN-I RP^r CTCCTTAGACCTAAGGCTCTCC 3r 其擴(kuò)增產(chǎn)物長度為498 bp ; IFN-2 FP^r ACAGGCACGACTTCGGCTTC 3r IFN-2 RP^r CGCAAGGGCTGTACTTCTTCTC 3r 其擴(kuò)增產(chǎn)物長度為321 bp。4. 依據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用小球藻表達(dá)人干擾素基因的方法，其特征所述 人干擾素HuIFN- a 2b基因的合成按照優(yōu)化后人干擾素你//W- a %基因人工合成該序列， 兩端加J/7III和分e I酶切位點(diǎn)，將pCAMBIA1304通過Afco /和分e /雙酶切，人工合成序 列構(gòu)建J/7III和分e I雙酶切，連接兩個片段構(gòu)建pCAMBIA1304-IFN表達(dá)載體。5. 依據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用小球藻表達(dá)人干擾素基因的方法，其特征所述 小球藻為蛋白核小球藻。
【專利摘要】本發(fā)明就是要提供一種利用小球藻表達(dá)人干擾素基因的方法，以小球藻為生物材料，包括HuIFN-α2b基因序列，用小球藻的偏好密碼子對人干擾素HuIFN-α2b基因序列進(jìn)優(yōu)化改造，其所述方法包括：1）利用小球藻的使用頻率高的偏好密碼子取代小球藻的使用頻率低的密碼子，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌；2）用大腸桿菌轉(zhuǎn)化子提取重組質(zhì)粒pCAMBIA1304-IFN，并轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌AGL-1；3）？利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小球藻轉(zhuǎn)化方法，將重組質(zhì)粒pCAMBIA1304-IFN中的T-DNA區(qū)整合入小球藻的基因組DNA中并表達(dá)。用小球藻的偏好密碼子對人干擾素（HuIFN-α2b）基因序列進(jìn)行優(yōu)化改造并人工合成該基因，利用根癌農(nóng)桿菌AGL-1介導(dǎo)的方法成功轉(zhuǎn)化蛋白核小球藻，獲得穩(wěn)定遺傳的小球藻轉(zhuǎn)化體，并檢測到人工合成干擾素與綠色熒光蛋白融合基因在蛋白核小球藻轉(zhuǎn)化細(xì)胞中成功表達(dá)。
【IPC分類】C12R1/89, C12N15/21, C12N15/79
【公開號】CN105087629
【申請?zhí)枴緾N201510597160
【發(fā)明人】盧其能, 周琨, 徐長豪, 李潤根
【申請人】宜春學(xué)院
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月18日