PCR鑒定與大腸桿菌相同；
[0164] 用根癌農(nóng)桿菌AGL-I介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化蛋白核小球藻：
[0165] 1)挑取農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子于IOmLLB液體培養(yǎng)基中（含50mg/LKan和50mg/LRif) 中，兩管，28°C，220rpm，搖床搖動(dòng)培養(yǎng)2天；
[0166] 2)將上述培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移至兩只50mL的滅菌離心管中，4000rpm，離心IOmin收集 菌體，倒掉上清液；
[0167] 3)向每只離心管中加入5mLIM培養(yǎng)基，將菌體重懸，4000rpm，離心IOmin收集菌 體，倒掉上清液；
[0168] 4)向每只離心管中加入適量頂培養(yǎng)基，使得菌液的初始OD6。。在0.2至0.3之間， 加入卡那霉素，使其終濃度為50mg/L，加入乙酰丁香酮，使其終濃度為150ymol/L，28°C， 150rpm，培養(yǎng) 6-8h，直至0D_達(dá)到0?8-1.O ;
[0169] 5)將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的蛋白核小球藻轉(zhuǎn)移至兩只I. 5mL的離心管中，4000rpm離心 lOmin，將上清液吸去；
[0170] 6)向每只離心管中加入ImL頂培養(yǎng)基，使蛋白核小球藻重懸，4000rpm離心 lOmin，將上清液吸去；
[0171] 7)將兩只離心管中的蛋白核小球藻濃縮重懸至ImUM培養(yǎng)基中；
[0172] 8)將100 y L誘導(dǎo)培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌菌液與100 y L上述蛋白核小球藻液混勻，裝入 旋蓋的I. 5mL的離心管中，管蓋擰松，25°C，生化培養(yǎng)箱黑暗共培養(yǎng)2天；
[0173]9)2天后將共培養(yǎng)藻液均勻涂布于選擇培養(yǎng)基上，28°C，生化培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)3 天，然后光照培養(yǎng)；
[0174] 轉(zhuǎn)化蛋白核小球藻除菌和遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)：
[0175] 1)挑取蛋白核小球藻轉(zhuǎn)化子于BG-11+lOg/LGlu液體培養(yǎng)基（含200mg/LAmp、 200mg/LCef)中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；
[0176] 2)用接種針蘸取上述藻液劃線(xiàn)于選擇培養(yǎng)基，培養(yǎng)觀(guān)察其生長(zhǎng)狀況；
[0177] 轉(zhuǎn)基因小球藻基因組DNA的提取和PCR驗(yàn)證：
[0178] 1)取IOmL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻，12000rpm，離心5min，棄上清收集藻體，濾紙 上倒置lmin，盡量?jī)A去殘留的痕量培養(yǎng)基；
[0179] 2)加入I. 5mLCTAB提取液重懸藻體，將藻液吸出至預(yù)冷的研缽，快速研磨，吸取 700yL研磨好的藻液至I. 5mL離心管中，65°C水浴50min，每十分鐘顛倒搖晃一次；
[0180] 3)水浴完成后加入700yL苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1)，充分混勻，12000rpm離 心lOmin，取上清至新的離心管中；
[0181] 4)向離心管中加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1)，充分混勾，12000rpm離心 lOmin，取上清至新的離心管中；
[0182] 5)向離心管中加入加入1/10體積的3mol/LNaAc(PH5. 2)，加入2倍體積的無(wú)水 乙醇，充分混勻，_20°C靜置30min以上；
[0183] 6) 12000印111離心15111；[11，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2次，加入300 11]^1￡緩沖 液溶解，加入 3yL10mg/L的RNaseA，37°C水浴 30min;
[0184] 7)重復(fù)步驟4, 5;
[0185] 8) 12000印111離心15111；[11，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2次，加入20 11]^滅菌去離 子水，-20 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0186] 9)小球藻基因組DNAPCR鑒定反應(yīng)體系及條件同前質(zhì)粒PCR鑒定，產(chǎn)物于1. 2% 瓊脂糖凝膠檢測(cè)。
[0187] 轉(zhuǎn)基因小球藻總RNA的提取和RT-PCR驗(yàn)證：
[0188] 1)取30mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻，12000rpm，離心5min，棄上清收集藻體，濾紙 上倒置lmin，盡量?jī)A去殘留的痕量培養(yǎng)基；
[0189] 2)將裝有藻體沉淀的離心管放入超低溫冰箱，待藻體凍結(jié)后取出，稱(chēng)取200mg左 右的藻體，利用天恩澤柱式植物RNAout試劑盒進(jìn)行如下操作；
[0190] 3)將藻體放入預(yù)冷的研缽，加入溶液A研磨（溶液A預(yù)先65 °C水?。?；
[0191] 4)取ImL研磨物至一滅菌的I. 5mL離心管中，加入0. 3mL的溶液B和0. 2mL的氯 仿，在振蕩器上振蕩30s將其混勻；
[0192] 5) 12000rpm離心5min，取上清液（約600yL)至新的滅菌離心管中，加入0? 5mL 的溶液C和0. 2mL的氯仿，
[0193] 6) 12000rpm離心3min，取上清液（約ImL)至一新的滅菌離心管中，加入0. 5倍體 積的溶液D，上下顛倒使之混勻；
[0194] 7)將一半的溶液轉(zhuǎn)移至裝入收集管的吸附柱中，12000rpm離心30s，棄收集管中 的廢液，然后將另一半加入同一吸附柱中進(jìn)行同樣的步驟；
[0195] 8)向吸附柱中加入0. 7mL通用洗柱液，12000rpm離心30s，棄廢液；
[0196] 9)向吸附柱繼續(xù)加0. 3mL通用洗柱液，12000rpm離心30s，棄廢液，再12000rpm離 心30s，去掉殘留的乙醇；
[0197] 10)將吸附柱轉(zhuǎn)移至DEPC水處理的RNase-free離心管，加入50yLRNA洗脫液， 室溫放置l_2min;
[0198] 11) 12000rpm離心30s，收集小球藻總RNA，將10yLRNA溶于2mLTE緩沖液中測(cè)其 OD26。，得出RNA的濃度；
[0199] 12)用DNaseI(RNase-free)除去RNA中的痕量DNA，剩余的RNA超低溫冰箱保 存。
[0200] 反應(yīng)體系（10yL)表3:
[0201]
[0202] 37°C反應(yīng)30min，向反應(yīng)液中加入IyL50mMEDTA，絡(luò)合反應(yīng)液中的Mg2+，65°C反應(yīng) lOmin，使DNaseI失活，利用TIANGENQuantcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行以下操作；
[0203] 13)將Oligo(dT)15、superpuredNTP、RNase-freeddH20、10XRTMix在室溫條 件下解凍，振蕩混勻，快速離心，然后立即置于冰上；
[0204] 14)按照下述體系將Oligo(dT)15、superpuredNTP、RNase_freeddH20 和 10XRT Mix混合，振蕩混勻，快速離心，置于冰上；
[0205] 15)將RNA模板加入反應(yīng)體系中，振蕩混勻，快速離心。
[0206] 反應(yīng)體系（10yL)表4:
[0207]
[0208] 37°C反應(yīng)60min，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物于1. 2%瓊脂糖凝 膠檢測(cè)。
[0209] 總蛋白提取：
[0210] 取IOmL野生小球藻藻液，12000rpm離心lOmin，取沉淀至預(yù)冷的研缽中，加入 200yL提取緩沖液1或提取緩沖液2,充分研磨，直至將藻體研磨碎，釋放出蛋白；6000rpm， 4°C離心lOmin，取上清，煮沸IOmin后12000rpm，4°C離心lOmin，取上清，4°C保存準(zhǔn)備上樣， 其余-20°C保存。
[0211] SDS-PAGE電泳：
[0212] 1?配置10 %的分離膠（去離子水4mL、30 %丙烯酰胺溶液2. 5mL、I. 5mol/ LTris-HCl0. 9mL^10%SDS75y10 %AP60yTEMED5yL)；
[0213] 2.將配好的分離膠沿著玻璃板邊緣加入制膠槽，在分離膠溶液上蓋一層異丙醇?jí)?膠，待分離膠凝固之后，吸去異丙醇；
[0214] 3?配置5 %的濃縮膠（去離子水2.lmL、30 %丙烯酰胺溶液0? 5mL、Imol/ LTris-HCl0. 37mL^ 10%SDS25y10 %AP25yTEMED5yL)；
[0215] 4.將配好的濃縮膠沿玻璃板邊緣加入制膠槽，插入梳子；
[0216] 5.待凝膠凝固后將膠板放入電泳槽中，加入IXTris-Glycinebuffer，使凝膠的 上下均浸泡在緩沖液中，拔出梳子；
[0217] 6.做提取緩沖液對(duì)蛋白提取影響時(shí)，上樣量選擇相同的體積，做WesternBlot 時(shí)，上樣量既要相同的質(zhì)量也要相同體積，每孔上樣量約20yg蛋白，根據(jù)蛋白定量結(jié)果取 相應(yīng)體積的蛋白樣品，加入5XSDS-PAGELoadingbuffer，煮沸IOmin后離心取上清上樣；
[0218] 7.濃縮膠選擇80V電壓，電泳20min，然后切換120V電壓，電泳60min，當(dāng)染料到達(dá) 凝膠底部時(shí)切斷電源，停止電泳，進(jìn)行下一步考染、銀染或轉(zhuǎn)膜進(jìn)行WB檢測(cè)。
[0219]WesternBlot：
[0220] 1.轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜前將NC膜和濾紙?jiān)陔娹D(zhuǎn)液中浸泡lOmin，膠也在電轉(zhuǎn)液中平衡 lmin，然后將膜、膠和濾紙排列成三明治式（濾紙三層/凝膠/NC膜/濾紙三層），用電轉(zhuǎn)液 浸濕后，置于電轉(zhuǎn)儀的正負(fù)極之間，凝膠在負(fù)極一端，NC膜在正極一端，9V，轉(zhuǎn)膜lh。
[0221] 2.麗春紅檢測(cè)膜上蛋白：將轉(zhuǎn)好的膜放入TBST中洗一次，置于麗春紅工作液中， 室溫下?lián)u床搖動(dòng)染色5min，，去離子水洗膜，直至水不再變色，蛋白條帶顯示出紅色條帶
[0222] 3.封閉；將100_1301(0&之間的膜切下來(lái)，用5%脫脂奶粉室溫封閉11 1
[0223] 4?孵育一抗：按照說(shuō)明書(shū)將Anti-6XHis_Tagantibody用 5%BSAl: 1000 稀釋?zhuān)?將抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，室溫孵育2h或者4°C孵育過(guò)夜
[0224] 5.孵育二抗：孵育一抗的NC膜用TBST洗3次，每次5min，然后將二抗用5 %脫脂 奶粉1:1000稀釋?zhuān)?7°C孵育lh，TBST洗3次，每次5min。
[0225] 6.顯色：將ECL發(fā)光液A和B等量混勻配置ECL發(fā)光液，加在NC膜的正面，暗室 避光5min，倒掉顯色液，用紙將顯色液吸掉，在膜上面蓋一層平整的透明紙。將膜放入凝膠 成像系統(tǒng)掃描，根據(jù)條帶強(qiáng)弱調(diào)整感光時(shí)間以達(dá)到理想效果；
[0226] 表達(dá)產(chǎn)物的觀(guān)察與驗(yàn)證：
[0227] 取生長(zhǎng)后期的轉(zhuǎn)基因小球藻與未轉(zhuǎn)基因的小球藻制成臨時(shí)玻片，在焚光顯微鏡下 觀(guān)察小球藻細(xì)胞是否有綠色熒光，以驗(yàn)證干擾素與綠色熒光蛋白的融合蛋白是否表達(dá)。
[0228] 結(jié)果與分析：
[0229] 人干擾素HuIFN-a2b基因的優(yōu)化設(shè)計(jì)：
[0230]人干擾素