一種具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌及篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]雙歧桿菌作為重要的腸道益生菌，其在抑制腸道有害菌的生長繁殖、抵抗病原茵的感染方面發(fā)揮著重要作用，雙歧桿菌能夠產(chǎn)生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有機(jī)酸刺激腸道蠕動(dòng)，促進(jìn)排便，防止便秘。雙歧桿菌還能夠刺激人體免疫系統(tǒng)，從而提高抗病能力、延緩衰老等。然而，雙歧桿菌如果能夠發(fā)揮上述作用，必須能夠在人體內(nèi)長期存在，即定殖。研究發(fā)現(xiàn)，部分雙歧桿菌具有腸道定殖的能力。比如，S.Fujiwara等發(fā)現(xiàn)具有鏈霉素和利福平抗性的長雙歧桿菌SBT2929能夠在人體內(nèi)長期定殖并且影響腸道微生物的組成和代謝；Nathan P.McNulty 等發(fā)現(xiàn)，Bifidobacterium animal is subsp.1actis 能夠在攝入高糖騰食的無菌鼠體內(nèi)定殖28天以上。
[0003]檢測雙歧桿菌能否在腸道內(nèi)定殖的方法主要有三種:一是利用雙歧桿菌的選擇培養(yǎng)基將糞便梯度稀釋后平板涂布進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；二是利用API 50CHL的試劑盒結(jié)合末端轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行糞便中雙歧桿菌的鑒定；三是利用DGGE (變性梯度凝膠電泳)的方法，提取糞便的宏基因組然后擴(kuò)增菌的16S V3區(qū)，與目標(biāo)雙歧桿菌進(jìn)行條帶比對確定雙歧桿菌能否在腸道內(nèi)定殖。平板計(jì)數(shù)的方法，存在比較明顯的缺陷:由于部分雙歧桿菌存在比較苛刻的生存條件，所以不能夠在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，因此即使是能夠在腸道內(nèi)定殖的雙歧桿菌用此方法鑒定也可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果；并且，選擇培養(yǎng)基不能夠?qū)⒉煌N的雙歧桿菌很好地區(qū)分開來。試劑盒的方法較為新穎，彌補(bǔ)了選擇培養(yǎng)基存在的不足，可以較好地進(jìn)行雙歧桿菌定殖能力的考量。同時(shí)，PCR-DGGE的方法由于技術(shù)相對比較成熟，且操作簡便，能夠很好地區(qū)分不同種的雙歧桿菌，且從條帶的亮度上可以大致地看出雙歧桿菌在腸道內(nèi)的定殖能力強(qiáng)弱。
[0004]人體腸道中雙歧桿菌的數(shù)量隨年齡的增長比例在減少，腸道微生物種類和比例的失衡會(huì)帶來許多的健康問題，諸如便秘、腹瀉、免疫力低下等，因此需要采取措施使腸道中的雙歧桿菌增殖。使腸道中雙歧桿菌增加的辦法有兩種:一是口服含雙歧桿菌的飲品或生物制劑；二是補(bǔ)充雙歧因子(如低聚糖等)促進(jìn)人體固有雙歧桿菌的繁殖。鑒于WHO對低聚糖，如低聚木糖、低聚果糖等的推薦攝入量，實(shí)驗(yàn)表明其對雙歧桿菌的增殖存在一定的局限性且效果不太明顯，因此補(bǔ)充雙歧因子的方法作用不大?？诜p歧桿菌的飲品或者生物制劑，只要雙歧桿菌能夠克服腸道的不利環(huán)境，就能在腸道內(nèi)直接地發(fā)揮作用。所以，篩選出能夠在腸道內(nèi)定殖的雙歧桿菌并且做成相關(guān)產(chǎn)品，具有巨大的應(yīng)用及商業(yè)價(jià)值。
[0005]通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請相關(guān)的專利公開文獻(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種具有耐酸、耐膽鹽特性，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明其能很好地粘附結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其能在小鼠體內(nèi)定殖10天甚至更長的一段時(shí)間，其在腸道定殖能力方面的優(yōu)良特性，具有巨大的應(yīng)用及商業(yè)價(jià)值的具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌及用途，該長雙歧桿菌能夠應(yīng)用于生產(chǎn)雙歧桿菌菌粉、酸奶和雙歧桿菌益生菌巧克力中。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
[0008]—種具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌，名稱為CCFM 729，分類名稱為Bifidobacterium longum，保藏編號(hào)為:CGMCC N0.10932，保藏日期:2015 年 05 月 28 日，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。
[0009]而且，所述長雙歧桿菌具有如下性質(zhì):
[0010]⑴具有耐酸性，在ρΗ3.0-9.0環(huán)境條件下生長良好，在pH 2.5環(huán)境下存活良好；
[0011]⑵能夠耐膽鹽，在0.3%膽鹽存在的條件下存活良好；
[0012]⑶具有粘附性，能夠較好地粘附在結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29上；
[0013]⑷能夠在小鼠體內(nèi)定殖10天以上的時(shí)間。
[0014]—種如上所述的具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌的篩選方法，步驟如下:
[0015]⑴收集若干份出生一周齡的嬰兒糞便，將糞便樣品在含有低聚果糖的MRS+0.5% -1% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸培養(yǎng)基中富集12h ;
[0016]⑵梯度稀釋涂布于添加0.02% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))溴甲酚紫的MRS+0.5%。_1%。(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸的固體平板上，培養(yǎng)24-48h;
[0017]⑶挑取變色圈明顯的單菌落，反復(fù)劃線得到純化的單菌落；
[0018]⑷將純化的單菌落液體培養(yǎng)24h后，進(jìn)行果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶的測定，快速鑒定其是否為雙歧桿菌；
[0019](5)選取F6PPK陽性的菌，提取其16S rDNA進(jìn)行測序；
[0020](6)選取測序結(jié)果鑒定為雙歧桿菌的乳酸菌進(jìn)行耐酸、耐膽鹽以及粘附試驗(yàn)；
[0021](7)選取耐酸、耐膽鹽以及粘附性能好的雙歧桿菌進(jìn)行腸道定殖能力試驗(yàn)，其中，耐酸:pH = 2?9，耐膽鹽:膽鹽0.3%、質(zhì)量分?jǐn)?shù)，粘附試驗(yàn):對結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29具有粘附能力；
[0022]⑶擴(kuò)增出小鼠糞便菌群的16S V3區(qū)，變性梯度凝膠電泳檢測小鼠糞便中的目標(biāo)菌，篩選出腸道定殖能力優(yōu)良的雙歧桿菌，即得具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌。
[0023]而且，具體步驟如下:
[0024](一)乳酸菌的分離篩選
[0025]⑴收集若干份出生一周齡的嬰兒糞便，將糞便樣品在含有低聚果糖的MRS+0.5% -1% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸培養(yǎng)基中富集12h ;
[0026]⑵將糞便樣品進(jìn)行梯度稀釋后涂布于添加了質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.02%溴甲酚紫的MRS+0.5% _1%。半胱氨酸的固體平板上，培養(yǎng)24-48h ；
[0027]⑶選取變色圈明顯，并且符合乳酸菌基本形態(tài)的單菌落進(jìn)行平板劃線純化，篩選分離出乳酸菌；
[0028]⑷將上述單菌落于液體MRS+0.5%0 ~1%0 (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸中培養(yǎng)24h后進(jìn)行革蘭氏染色，選取革蘭氏陽性菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；
[0029]( 二 )雙歧桿菌的初步鑒定:果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶測定法
[0030]⑴將步驟(一)所篩選得到的乳酸菌在液體MRS+0.5% -1% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸中培養(yǎng)24h，然后取ImL培養(yǎng)物8000rpm離心2min ；
[0031]⑵用含0.05% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸的pH = 6.5的0.05M KH2PO4溶液洗滌兩次；
[0032]⑶重懸于200uL添加了 0.25% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))Triton X-100的上述磷酸鹽緩沖液；
[0033]⑷添加50uL濃度為6mg/mL氟化鈉和10mg/mL碘乙酸鈉的混合液以及50uL濃度為80mg/mL的果糖-6-磷酸，37°C孵育Ih ;
[0034](5)添加300uL濃度為0.139g/mL、pH為6.5的鹽酸羥胺，并于室溫放置1min ；
[0035](6)分別添加200uL 15% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))的三氯乙酸和4M HCl ；
[0036](7)添加200uL含有5% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))三氯化鐵的0.1M HCl，若體系迅速變?yōu)榧t色，即為F6PPK陽性，可初步斷定其為雙歧桿菌；
[0037](三)雙歧桿菌的分子生物學(xué)鑒定
[0038]⑴單菌的基因組抽提
[0039]A.將步驟(二)所篩選得到的乳酸菌培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)過夜的菌懸液ImL于1.5mL離心管，1000rpm離心2min，棄上清得菌體；
[0040]B.用ImL無菌水吹打洗菌體后，1000rpm離心2min，棄上清得菌體；
[0041]C.加入 200uL SDS 裂解液，80°C水浴 30min ；
[0042]D.加入酚-氯仿溶液200uL于菌體裂解液中，其中酚-氯仿溶液的組成成分及體積比為:Tris飽和酸:氯仿:異戊醇=25:24:1，顛倒混勾后，12000rpm離心5-lOmin，取上清 200uL ；
[0043]E.加入400uL冰乙醇或冰異丙醇于200uL上清中，_20°C靜置lh，12000rpm離心5-10min,棄上清；
[0044]F.加入500uL 70% (體積百分?jǐn)?shù))冰乙醇重懸沉淀，12000rpm離心l_3min，棄上清;
[0045]G.60°C烘箱烘干，或者自然晾干；
[0046]H.50uL ddH20 重溶沉淀以備 PCR ；
[0047](2) 16S rDNA PCR
[0048]A.細(xì)菌 16S rDNA 50uL PCR 反應(yīng)體系:
[0049]10 X Taq buffer, 5uL ;dNTP，5uL ;27F，0.5uL ;1492R，0.5uL ；Taq 酶，0.5uL ；
[0050]模板，0.f5uL ;ddH20，38uL。
[0051]B.PCR 條件:
[0052]95°C 5min ；95°C 1s ；55°C 30s ；72°C 30s ；step 2-430X ；72°C 5min ；12°C 2min ；
[0053](3)制備I %瓊脂糖凝膠，之后將PCR產(chǎn)物與10000 X loading buffer混合，上樣量5uL，120V跑30min，然后進(jìn)行凝膠成像；
[0054]⑷將16S rDNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，將得到的序列結(jié)果使用BLAST在GeneBank中進(jìn)行搜索和相似性比對，選取測序結(jié)果鑒定為雙歧桿菌的乳酸菌，-80°C保藏備用；
[0055](四)雙歧桿菌的耐酸、耐膽鹽檢測
[0056]⑴取步驟(三)中-80°C保藏的雙歧桿菌，在MRS+0.5% _1%。(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸的固體平板劃線一次，在厭氧工作站培養(yǎng)24-48h之后轉(zhuǎn)接到MRS+0.5%。_1%。(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸的液體試管當(dāng)中，傳代兩次；
[0057]⑵以4%的接種量分別接種到pH = 7.0±0.2的MRS+0.5% _1%。(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸的液體試管，其為空白對照組；pH = 2、pH = 2.5、pH = 3、pH = 4、pH = 5、pH =6、pH = 8、pH = 9的MRS+0.5% _1%。(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸的液體試管，該幾組為耐酸實(shí)驗(yàn)組；MRS+0.5%。_1%。(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸+0.1%、0.2%、0.3%、0.4%牛膽鹽的液體試管中，該幾組為耐膽鹽實(shí)驗(yàn)組；
[0058]⑶將接種于上述液體試管當(dāng)中的菌懸液振蕩混勻后，迅速將其以200uL/孔的量轉(zhuǎn)移到96孔板上，每組做三個(gè)平行，每隔兩個(gè)小時(shí)用酶標(biāo)儀測定其OD6。。的值；
[0059]⑷在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)與對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)相差越小說明其耐受性能越好，比較菌的耐受性強(qiáng)弱；
[0060](5)因人體腸道內(nèi)環(huán)境中胃酸的pH在2.5左右，分泌的膽鹽含量為0.