驗； (7)選取耐酸、耐膽鹽以及粘附性能好的雙歧桿菌進行腸道定殖能力試驗，其中，耐酸:pH = 2?9，耐膽鹽:膽鹽0.3%、質(zhì)量分數(shù)，粘附試驗:對結腸癌細胞HT-29具有粘附能力； ⑶擴增出小鼠糞便菌群的16S V3區(qū)，變性梯度凝膠電泳檢測小鼠糞便中的目標菌，篩選出腸道定殖能力優(yōu)良的雙歧桿菌，即得具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌。4.根據(jù)權利3所述的具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌的篩選方法，其特征在于:具體步驟如下: (一)乳酸菌的分離篩選 ⑴收集若干份出生一周齡的嬰兒糞便，將糞便樣品在含有低聚果糖的MRS+0.5% -1% (質(zhì)量百分數(shù))半胱氨酸培養(yǎng)基中富集12h ; ⑵將糞便樣品進行梯度稀釋后涂布于添加了質(zhì)量百分數(shù)為0.02%溴甲酚紫的MRS+0.5% _1%。半胱氨酸的固體平板上，培養(yǎng)24-48h ； ⑶選取變色圈明顯，并且符合乳酸菌基本形態(tài)的單菌落進行平板劃線純化，篩選分離出乳酸菌； ⑷將上述單菌落于液體MRS+0.5% -1% (質(zhì)量百分數(shù))半胱氨酸中培養(yǎng)24h后進行革蘭氏染色，選取革蘭氏陽性菌進行后續(xù)試驗； (二 )雙歧桿菌的初步鑒定:果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶測定法 ⑴將步驟(一)所篩選得到的乳酸菌在液體MRS+0.5%-1%。(質(zhì)量百分數(shù))半胱氨酸中培養(yǎng)24h，然后取ImL培養(yǎng)物8000rpm離心2min ； ⑵用含0.05% (質(zhì)量百分數(shù))半胱氨酸的pH = 6.5的0.05M KH2PO4溶液洗滌兩次；⑶重懸于200uL添加了 0.25% (質(zhì)量百分數(shù))Triton X-100的上述磷酸鹽緩沖液；⑷添加50uL濃度為6mg/mL氟化鈉和10mg/mL碘乙酸鈉的混合液以及50uL濃度為80mg/mL的果糖-6-磷酸，37°C孵育Ih ; (5)添加300uL濃度為0.139g/mL、pH為6.5的鹽酸羥胺，并于室溫放置1min ； (6)分別添加200uL15% (質(zhì)量百分數(shù))的三氯乙酸和4M HCl ; (7)添加200uL含有5%(質(zhì)量百分數(shù))三氯化鐵的0.1M HCl，若體系迅速變?yōu)榧t色，SP為F6PPK陽性，可初步斷定其為雙歧桿菌； (三)雙歧桿菌的分子生物學鑒定 ⑴單菌的基因組抽提 A.將步驟(二)所篩選得到的乳酸菌培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)過夜的菌懸液ImL于1.5mL離心管，1000rpm離心2min，棄上清得菌體； B.用ImL無菌水吹打洗菌體后，1000rpm離心2min，棄上清得菌體； C.加入200uLSDS裂解液，80°C水浴30min ; D.加入酚-氯仿溶液200uL于菌體裂解液中，其中酚-氯仿溶液的組成成分及體積比為:Tris飽和酸:氯仿:異戊醇=25:24:1，顛倒混勾后，12000rpm離心5_10min，取上清200uL ； E.加入400uL冰乙醇或冰異丙醇于200uL上清中，-20°C靜置Ih，12000rpm離心5-10min,棄上清； F.加入500uL70% (體積百分數(shù))冰乙醇重懸沉淀，12000rpm離心l-3min，棄上清； G.60°C烘箱烘干，或者自然晾干； H.50uL ddH20重溶沉淀以備PCR ；⑵ 16S rDNA PCR A.細菌16SrDNA 50uL PCR反應體系:1XTaq buffer，5uL ;dNTP，5uL ;27F，0.5uL ; 1492R，0.5uL ;Taq 酶，0.5uL ;模板，0.5uL ；ddH20, 38uL。 B.PCR條件:95°C 5min ；95°C 1s ；55°C 30s ；72°C 30s ；step 2-4 30X ；72°C 5min ；12°C 2min ；⑶制備I %瓊脂糖凝膠，之后將PCR產(chǎn)物與10000 X loading buffer混合，上樣量5uL，120V跑30min，然后進行凝膠成像； ⑷將16S rDNA的PCR產(chǎn)物進行測序分析，將得到的序列結果使用BLAST在GeneBank中進行搜索和相似性比對，選取測序結果鑒定為雙歧桿菌的乳酸菌，-80°C保藏備用； (四)雙歧桿菌的耐酸、耐膽鹽檢測 ⑴取步驟(三)中-80°C保藏的雙歧桿菌，在MRS+0.5% -1% (質(zhì)量百分數(shù))半胱氨酸的固體平板劃線一次，在厭氧工作站培養(yǎng)24-48h之后轉接到MRS+0.5% -1%。(質(zhì)量百分數(shù))半胱氨酸的液體試管當中，傳代兩次； ⑵以4%的接種量分別接種到pH = 7.0±0.2的MRS+0.5% -1%。(質(zhì)量百分數(shù))半胱氨酸的液體試管，其為空白對照組；pH = 2、pH = 2.5、pH = 3、pH = 4、pH = 5、pH = 6、pH=8、pH = 9的MRS+0.5% _1%。(質(zhì)量百分數(shù))半胱氨酸的液體試管，該幾組為耐酸實驗組;MRS+0.5%o -1% (質(zhì)量百分數(shù))半胱氨酸+0.1%,0.2%,0.3%,0.4%牛膽鹽的液體試管中，該幾組為耐膽鹽實驗組； ⑶將接種于上述液體試管當中的菌懸液振蕩混勻后，迅速將其以200uL/孔的量轉移到96孔板上，每組做三個平行，每隔兩個小時用酶標儀測定其OD6。。的值； ⑷在每一個時間點，將實驗組數(shù)據(jù)與對照組數(shù)據(jù)進行比較，數(shù)據(jù)相差越小說明其耐受性能越好，比較菌的耐受性強弱； (5)因人體腸道內(nèi)環(huán)境中胃酸的pH在2.5左右，分泌的膽鹽含量為0.1%?0.5%，攝入的活菌通過腸道的時間在2小時，所以選取在2小時內(nèi)在pH = 2.5環(huán)境下存活良好、在0.3%膽鹽存在的條件下存活良好的雙歧桿菌進行后續(xù)試驗； (五)雙歧桿菌對結腸癌細胞HT-29的粘附能力測定 ⑴將放置于液氮罐中的HT-29細胞的凍存管迅速置于37°C水浴鍋中使其融化； ⑵將其與PRM1-1640完全培養(yǎng)基混合后，置于培養(yǎng)皿中，于5%二氧化碳培養(yǎng)箱37V傳代培養(yǎng)，每隔一天換一次培養(yǎng)液； 其中，所述PRM1-1640完全培養(yǎng)基為PRM1-1640基礎培養(yǎng)基+10% (質(zhì)量百分數(shù))胎牛血清+1 % (質(zhì)量百分數(shù))青鏈霉素； ⑶待傳代細胞3-4次后，再次長滿80%細胞培養(yǎng)板之后，胰酶消化，PBS清洗后，離心，用PRM1-1640基礎培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為15ceIls/mL，并且在事先置入載玻片的細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)6h ； ⑷將步驟(四)所篩選得到的雙歧桿菌過夜培養(yǎng)，用PRM1-1640基礎培養(yǎng)基調(diào)整過夜培養(yǎng)的菌懸液的濃度為107cfu/mL，與上述HT-29細胞共培養(yǎng)4h ; (5)PBS清洗4次，然后用甲醇固定5-10min，甲醇的添加量以鋪滿細胞培養(yǎng)板為宜，之后用姬姆薩染液進行染色； (6)用PBS洗液沖洗染液至無色，于37°C培養(yǎng)箱干燥過夜或者常溫放置至自然干燥； (7)取出載玻片，在100倍的油鏡下進行觀察，選取屬于具有強粘附能力的乳酸菌；其中，20個隨機選取的視野當中總的細菌數(shù)大于100個，即屬于粘附能力強的菌； (六)雙歧桿菌在小鼠腸道內(nèi)的定殖情況測定 試驗小鼠為6-8周齡SPF級雌性小鼠，每天灌胃重懸于生理鹽水中的步驟(五)所篩選得到的乳酸菌，菌濃度為10scfU/mL，灌胃周期為14天，在灌胃前采集小鼠糞便一次，灌胃中和灌胃結束后隔天采集小鼠糞便，之后用Fast DNAkit for soil提取小鼠的糞便基因組，擴增基因組的16S V3區(qū)，變性梯度凝膠電泳檢測小鼠糞便中的目標菌，篩選出腸道定殖能力優(yōu)良的雙歧桿菌，即得具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌。5.如權利要求1或2所述的具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌在生產(chǎn)雙歧桿菌菌粉中的應用。6.根據(jù)權利要求5所述的具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌在生產(chǎn)雙歧桿菌菌粉中的應用，其特征在于:所述雙歧桿菌菌粉的制備步驟如下: ⑴培養(yǎng)基的制備:長雙歧桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為添加質(zhì)量百分數(shù)為0.5%。_1%。的L-半胱氨酸的MRS培養(yǎng)基，pH為6.8±0.2 ; ⑵保護劑的制備:使用水與凍干保護劑原料混合，制備得到含有100g/L?150g/L脫脂奶粉、100g/L?200g/L海藻糖、100g/L?150g/L蔗糖、余量為水的凍干保護劑； ⑶將長雙歧桿菌CCFM 729菌種按照2-4%的接種量接種到在115°C下滅菌20min的步驟⑴中培養(yǎng)基中，然后在溫度37°C的條件下于厭氧工作站中培養(yǎng)24h，6000 X g離心15min ;用pH = 7.2的磷酸鹽緩沖液清洗2-3次；之后用步驟⑵中凍干保護劑重懸，使菌的濃度達到1wCfVmL ;然后將該菌懸液在37°C厭氧的條件下培養(yǎng)lh，再在_20°C預凍12h ;最后進行真空冷凍干燥得到所述的雙歧桿菌菌粉。7.如權利要求1或2所述的具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌在生產(chǎn)酸奶中的應用或在生產(chǎn)雙歧桿菌益生菌巧克力中的應用。8.根據(jù)權利要求7所述的具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌在生產(chǎn)酸奶中的應用，其特征在于:所述長雙歧桿菌發(fā)酵菌株復配使用。9.根據(jù)權利要求8所述的具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌在生產(chǎn)酸奶中的應用，其特征在于:所述發(fā)酵菌株為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌。10.根據(jù)權利要求7所述的具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌在生產(chǎn)酸奶中的應用，其特征在于:所述酸奶的制備步驟如下: ⑴首先制作雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑，所述雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑為權利要求6所述的雙歧桿菌菌粉； ⑵培養(yǎng)基的制備:將脫脂乳粉按照12-15:100(g/mL)的比例與水混合，然后105°C滅菌20min，得脫脂乳； ⑶將步驟⑴中雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑與嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌按照質(zhì)量比為1:1:1的比例添加到步驟⑵的脫脂乳中，攪拌均勻； ⑷發(fā)酵8-12h，發(fā)酵溫度為:37°C，發(fā)酵完成后在4°C冷藏Sh左右，即得酸奶； 或者，所述雙歧桿菌益生菌巧克力的制備步驟如下: ⑴首先制作雙歧桿菌菌粉，所述雙歧桿菌菌粉為權利要求6所述的雙歧桿菌菌粉； ⑵將市售可可粉、可可脂、砂糖按比例混合并于熱水中不斷攪拌至膏狀； ⑶將步驟⑴中雙歧桿菌菌粉加入到步驟⑵所得膏狀物中，并迅速攪拌，倒入模具，自然冷卻，即得益生菌巧克力。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌，名稱為CCFM？729，分類名稱為Bifidobacterium？longum，保藏編號為：CGMCC？No.10932，保藏日期：2015年05月28日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。本發(fā)明長雙歧桿菌(Bifidobacterium？longum)CCFM？729最初來源于出生一周齡的嬰兒糞便，體外實驗表明其具有耐酸、耐膽鹽特性，細胞實驗表明其能很好地粘附結腸癌細胞HT-29，動物實驗表明其能在小鼠體內(nèi)定殖10天甚至更長的一段時間，其在腸道定殖能力方面的優(yōu)良特性，具有巨大的應用及商業(yè)價值，其可用于制作雙歧桿菌菌粉以及與嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌聯(lián)合發(fā)酵生產(chǎn)酸奶，制成益生菌巧克力等，具有廣闊的應用前景。CGMCC No. 1093220150528
【IPC分類】A23C9/127, C12Q1/68, C12R1/01, C12N1/20, C12Q1/04, A23G1/42
【公開號】CN105112333
【申請?zhí)枴緾N201510549092
【發(fā)明人】陳衛(wèi), 趙國忠, 韓俊燕, 王夢穎, 張灝, 趙建新, 田豐偉, 張秋香, 張白曦, 王剛, 劉小鳴, 郭敏
【申請人】江南大學
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月31日