烘箱烘干，或者自然晾干；
[0127]H.50uL ddH20 重溶沉淀以備 PCR。
[0128](2) 16S rDNAPCR
[0129]A.細(xì)菌 16S rDNA 50uL PCR 反應(yīng)體系:
[0130]10 X Taq buffer, 5uL ;dNTP，5uL ;27F，0.5uL ;1492R，0.5uL ；Taq 酶，0.5uL ；
[0131]模板，0.5uL ;ddH20，38uL。
[0132]B.PCR 條件:
[0133]95°C 5min ；95°C 1s ；55°C 30s ；72°C 30s ；step 2-430X ；72°C 5min ；12°C 2min ；
[0134](3)制備I %瓊脂糖凝膠，之后將PCR產(chǎn)物與10000 X loading buffer混合，上樣量5uL，120V跑30min，然后進(jìn)行凝膠成像。
[0135]⑷將16S rDNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，將得到的序列結(jié)果使用BLAST在GeneBank中進(jìn)行搜索和相似性比對，選取測序結(jié)果鑒定為雙歧桿菌的乳酸菌，-80°C保藏備用。
[0136](四)長雙歧桿菌CCFM729生長曲線的繪制及耐酸、耐膽鹽檢測
[0137]取-80°C保藏的長雙歧桿菌CCFM 729，將其在MRS+0.5%。半胱氨酸的固體平板上劃線培養(yǎng)。在37°C厭氧工作站培養(yǎng)48小時(shí)后，從生長良好的長雙歧桿菌單菌落上挑取雙歧桿菌細(xì)胞接種到MRS+0.5%。半胱氨酸的液體培養(yǎng)基中于厭氧工作站內(nèi)靜置培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)溫度為37°C。然后按2%的接種量將此活化后的長雙歧桿菌CCFM 729培養(yǎng)液接種到MRS+0.5%。半胱氨酸的液體培養(yǎng)基中于厭氧工作站內(nèi)靜置培養(yǎng)36小時(shí)，培養(yǎng)溫度為37°C，每隔3小時(shí)取5mL培養(yǎng)液使用紫外分光光度計(jì)測600nm下的OD值并進(jìn)行梯度稀釋后平板涂布計(jì)數(shù)，根據(jù)結(jié)果繪制長雙歧桿菌CCFM 729的生長曲線，其結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出:長雙歧桿菌CCFM 729在MRS+0.5%。半胱氨酸的培養(yǎng)基中生長迅速，延滯期較短，大約在3h之后進(jìn)入對數(shù)期，21h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌株生長產(chǎn)酸，pH不斷降低，進(jìn)入穩(wěn)定期后，pH下降趨勢漸緩。36h培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，培養(yǎng)液的pH值為4.12，培養(yǎng)液中活菌濃度可以達(dá)到5.6X 109cfu/mL。
[0138]耐酸、耐膽鹽檢測:(I)取-80 °C保藏的雙歧桿菌，在MRS+0.5 0Z00 -1 0Z00 (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸的固體平板劃線一次，在厭氧工作站培養(yǎng)24-48h之后轉(zhuǎn)接到MRS+0.5% -1% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸的液體試管當(dāng)中，傳代兩次；
[0139](2)以4%的接種量分別接種到pH = 7.0±0.2的MRS+0.5% -1%。(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸的液體試管(空白對照組)；pH = 2、pH = 2.5、pH = 3、pH = 4、pH = 5、pH = 6、pH = 8, pH = 9的MRS+0.5% _1%。(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸的液體試管(耐酸實(shí)驗(yàn)組)；MRS+0.5%-1%0 (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸+0.1%、0.2%、0.3%、0.4%牛膽鹽的液體試管中(耐膽鹽實(shí)驗(yàn)組)；
[0140](3)將接種于上述液體試管當(dāng)中的菌懸液振蕩混勻后，迅速將其以200uL/孔的量轉(zhuǎn)移到96孔板上，每組做三個(gè)平行，每隔兩個(gè)小時(shí)用酶標(biāo)儀測定其OD6。。的值；
[0141 ] (4)在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)與對照組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，數(shù)據(jù)相差越小說明其耐受性能越好，比較菌的耐受性強(qiáng)弱；
[0142](5)因人體腸道內(nèi)環(huán)境中胃酸的pH在2.5左右，分泌的膽鹽含量約為0.3%，攝入的活菌通過腸道的時(shí)間在2小時(shí)左右，所以選取在2小時(shí)內(nèi)在pH = 2.5環(huán)境下存活良好、在0.3%膽鹽存在的條件下存活良好的雙歧桿菌進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
[0143]經(jīng)檢測，該菌具有耐酸性，在pH3.0-9.0環(huán)境條件下生長良好，在pH 2.5環(huán)境下存活良好；
[0144]且其能夠耐膽鹽，在0.3%膽鹽存在的條件下存活良好。
[0145](五)長雙歧桿菌CCFM729對結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的粘附能力測定
[0146]⑴將放置于液氮罐中的HT-29細(xì)胞的凍存管迅速置于37 °C水浴鍋中使其融化；
[0147]⑵將其與PRM1-1640完全培養(yǎng)基(PRM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素)混合后，置于培養(yǎng)皿中，于5%二氧化碳培養(yǎng)箱37°C傳代培養(yǎng)，每隔一天換一次培養(yǎng)液；
[0148]⑶待傳代細(xì)胞3-4次后，再次長滿(80% )細(xì)胞培養(yǎng)板之后，胰酶消化，PBS清洗后，離心，用PRM1-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為15ceIls/mL，并且在事先置入載玻片的細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)6h ;
[0149]⑷將步驟(四)所篩選得到的雙歧桿菌過夜培養(yǎng)，用PRM1-1640調(diào)整過夜培養(yǎng)的菌懸液的濃度為107cfu/mL，與上述HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)4h ;
[0150](5)PBS清洗4次，然后用甲醇固定5-10min，甲醇的量以鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)板為宜，之后用姬姆薩染液進(jìn)行染色；
[0151](6)用PBS洗液沖洗染液至無色，于37 °C培養(yǎng)箱干燥過夜(或者常溫放置至自然干燥)；
[0152](7)用100倍的油鏡進(jìn)行觀察，如圖4所示。從圖4結(jié)果可以看出，長雙歧桿菌CCFM729能夠很好地粘附于結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的表面，且按照C.N.JACOBSEN的說法，長雙歧桿菌CCFM 729屬于具有強(qiáng)粘附能力的乳酸菌。
[0153](六)長雙歧桿菌CCFM729在小鼠腸道內(nèi)的定殖情況測定
[0154]試驗(yàn)小鼠為6-8周齡SPF級(jí)雌性小鼠，每天灌胃重懸于生理鹽水中的長雙歧桿菌CCFM 729，菌濃度為10scfU/mL。灌胃周期為14天，在灌胃前采集小鼠糞便一次，灌胃中和灌胃結(jié)束后隔天采集小鼠糞便。之后用Fast DNAkit for soil提取小鼠的糞便基因組，擴(kuò)增基因組的16S V3區(qū)，然后跑DGGE，結(jié)果如圖5所示。由圖5的結(jié)果可以看出，長雙歧桿菌CCFM 729在灌胃之前在小鼠的糞便中檢測不到，在灌胃中可以檢測到，在灌胃結(jié)束后的2、
4、6、8、10天均可以檢測到，由此結(jié)果可以推測，長雙歧桿菌CCFM 729可以在小鼠體內(nèi)定殖至少10天，甚至是更長的一段時(shí)間。
[0155]本發(fā)明具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌具有如下性質(zhì):
[0156]⑴具有耐酸性，在pH3.0-9.0環(huán)境條件下生長良好，在pH 2.5環(huán)境下存活良好；
[0157]⑵能夠耐膽鹽，在0.3%膽鹽存在的條件下存活良好；
[0158]⑶具有粘附性，能夠較好地粘附在結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29上；
[0159]⑷能夠在小鼠體內(nèi)定殖10天，甚至更長的時(shí)間。
[0160]本發(fā)明具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌的相關(guān)應(yīng)用:
[0161]應(yīng)用例1:應(yīng)用于雙歧桿菌菌粉的制作中
[0162](I)培養(yǎng)基的制備:所述長雙歧桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為添加質(zhì)量百分?jǐn)?shù)0.5% L-半胱氨酸的MRS培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.8 ± 0.2 ;
[0163](2)保護(hù)劑的制備:使用水與凍干保護(hù)劑原料混合制備得到含有100g/L脫脂奶粉、100g/L海藻糖、150g/L蔗糖、余量為水的凍干保護(hù)劑；
[0164](3)將長雙歧桿菌CCFM 729菌種按照2_4%的接種量接種到在115°C下滅菌20min的步驟⑴中培養(yǎng)基中，然后在溫度37°C的條件下于厭氧工作站中培養(yǎng)24h，6000Xg離心15min ;用pH = 7.2的磷酸鹽緩沖液清洗2_3次；之后用步驟⑵中凍干保護(hù)劑重懸，使菌的濃度達(dá)到lOlfu/mL ;然后將該菌懸液在37°C厭氧的條件下培養(yǎng)lh，再在_20°C預(yù)凍12h ;最后進(jìn)行真空冷凍干燥得到所述的雙歧桿菌菌粉。
[0165](4)經(jīng)平板涂布計(jì)數(shù)，所得的雙歧桿菌菌粉菌的濃度達(dá)到lOlfu/g，真空包裝并冷藏I個(gè)月后，活菌數(shù)仍保持在lOlfu/g。
[0166]應(yīng)用例2:雙歧桿菌與嗜熱鏈球菌等復(fù)合菌株復(fù)配生產(chǎn)酸奶
[0167](I)首先制作雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑，所述雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑為應(yīng)用例I中制得的雙歧桿菌菌粉；
[0168]⑵培養(yǎng)基的制備:將脫脂乳粉按照12-15:100 (g/mL)的比例與水混合，然后105°C滅菌20min，得脫脂乳；
[0169]⑶將步驟⑴中雙歧桿菌酸奶發(fā)酵劑與嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌按照1:1:1的比例添加到步驟⑵的脫脂乳中；
[0170]⑷發(fā)酵8_12h，發(fā)酵溫度為:37°C，發(fā)酵完成后在4°C冷藏Sh左右，即得酸奶。
[0171](5)經(jīng)平板涂布計(jì)數(shù)，所得的酸奶活菌數(shù)達(dá)到109(^1!/^，在2-6°(:冷藏7天，仍具有較佳的口感，活菌數(shù)仍能夠達(dá)到10scfu/g。
[0172]應(yīng)用例3:雙歧桿菌用于制作雙歧桿菌益生菌巧克力
[0173]⑴首先制作雙歧桿菌菌粉，所述雙歧桿菌菌粉為權(quán)利要求6所述的雙歧桿菌菌粉；
[0174]⑵將市售可可粉、可可脂、砂糖按適當(dāng)比例混合并于熱水中不斷攪拌至膏狀；
[0175]⑶將步驟⑴中雙歧桿菌菌粉加入到步驟(2)所得膏狀物中，并迅速攪拌，倒入模具，自然冷卻，即得益生菌巧克力。
[0176](5)將巧克力壓碎并平板涂布計(jì)數(shù)，所得的益生菌巧克力活菌數(shù)達(dá)到109cfu/g，在2-6°C冷藏半個(gè)月，活菌數(shù)仍能夠達(dá)到10scfu/g。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌，其特征在于:名稱為CCFM 729，分類名稱為 Bifidobacterium longum，保藏編號(hào)為:CGMCC N0.10932，保藏日期:2015 年 05 月 28日，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌，其特征在于:所述長雙歧桿菌具有如下性質(zhì): ⑴具有耐酸性，在PH3.0-9.0環(huán)境條件下生長良好，在pH 2.5環(huán)境下存活良好； ⑵能夠耐膽鹽，在0.3%膽鹽存在的條件下存活良好； ⑶具有粘附性，能夠較好地粘附在結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29上； ⑷能夠在小鼠體內(nèi)定殖10天以上的時(shí)間。3.一種如權(quán)利要求1或2所述的具有良好腸道定殖能力的長雙歧桿菌的篩選方法，其特征在于:步驟如下: ⑴收集若干份出生一周齡的嬰兒糞便，將糞便樣品在含有低聚果糖的MRS+0.5% -1% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸培養(yǎng)基中富集12h ; ⑵梯度稀釋涂布于添加0.02% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))溴甲酚紫的MRS+0.5%q-1%。(質(zhì)量百分?jǐn)?shù))半胱氨酸的固體平板上，培養(yǎng)24-48h; ⑶挑取變色圈明顯的單菌落，反復(fù)劃線得到純化的單菌落； ⑷將純化的單菌落液體培養(yǎng)24h后，進(jìn)行果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶的測定，快速鑒定其是否為雙歧桿菌； (5)選取F6PPK陽性的菌，提取其16SrDNA進(jìn)行測序； (6)選取測序結(jié)果鑒定為雙歧桿菌的乳酸菌進(jìn)行耐酸、耐膽鹽以及粘附試