洗滌劑酶的微囊化的制作方法
【專利說明】洗讓劑酶的微囊化 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及使用微囊穩(wěn)定洗涂劑中的酶。
[000引背景
[0003] 本發(fā)明設(shè)及含酶顆粒，其中該酶可W被可控地保持在運些顆粒之內(nèi)，盡管其他材 料會遷移通過運些顆粒的壁。特定地，本發(fā)明設(shè)及液體洗涂劑濃縮物，其包含顆粒，運些顆 粒包含一種酶，由此該酶在該濃縮物中是受保護的但是當(dāng)該濃縮物在沖洗水中稀釋時被釋 放。特定地，優(yōu)選地設(shè)及運類包含兩種酶的濃縮物，其中一種通常會使另一種失活，但是運 兩種酶在該濃縮物中受到保護不互相影響，而運兩種酶在沖洗水中稀釋時是可獲得的。
[0004] 在將有效成分在聚合顆粒中微囊化，W便嘗試在儲存期間保護該有效成分不受環(huán) 境影響而當(dāng)需要時允許釋放方面存在大量現(xiàn)有技術(shù)。在一些方法中，該有效成分通過一個 聚合物基質(zhì)分布。在其他方法中，該有效成分存在于顆粒的核屯、中，該顆粒具有聚合物殼。 在一些方法中，存在一種圍繞核屯、的聚合物殼，該核屯、包含聚合物基質(zhì)和該有效成分。
[0005] 已知希望的是將洗涂劑酶包含在液體洗涂劑濃縮物中。在文獻中已經(jīng)有許多建議 通過提供連續(xù)的殼和/或基質(zhì)（其旨在保護酶免受濃縮物的影響而當(dāng)洗涂劑濃縮物被加入 水中W提供沖洗水時釋放它）W保護酶免受濃縮物的連續(xù)相和/或水的影響。實例在EP 356, 239和WO92/20771、W及在其中討論的現(xiàn)有技術(shù)中給出。運些、W及其他已知的方法 通常設(shè)及通過凝聚形成殼。
[0006] 不幸的是，很難在一方面選擇凝聚聚合物及其使用條件，并且在另一方面選擇聚 合物組合物或其他核屯、組合物，從而在具有高比表面積的顆粒中獲得最佳保護和所需的釋 放性能。通常，要么該殼過于不可透過使得當(dāng)需要時無法給出有效釋放，要么該殼允許過早 釋放。
[0007] 由于該酶在儲存期間通過凝聚殼的高比表面積滲透的傾向，如果當(dāng)需要時該殼能 夠給出完全釋放，液體洗涂劑中似乎出現(xiàn)了一個具體問題。運可能部分是由于該酶相當(dāng)?shù)?的分子體積（由于洗涂劑酶典型地具有級別為20至IOOkDa的分子量）聯(lián)合許多聚合物膜 對于運樣尺寸的分子可能是可透過或可半透過的事實。因此，在長時間膽存的情況下，顯著 數(shù)量的酶可W通過該殼的大比表面積遷移，即使該殼的可透性似乎是低的。如果該殼制被 制成足夠厚或者交聯(lián)W最小化其發(fā)生的風(fēng)險，那么很難達到酶的足夠釋放。
[0008] 除了凝聚之外，已知不同的膠囊化技術(shù)用于不同目的并且有運樣一種已經(jīng)被用于 其他目的的技術(shù)是界面縮合（interfacialcondensation) (IFC)聚合。IFC膠囊化技術(shù)通 常在水包油分散體中進行（運樣油相變成了核屯、），但是還已知在油包水分散體中進行（運 樣水相變成了核屯、）進行IFC膠囊化。
[0009] 格倫沃爾德（Grunwald)等人，"用于固定多酶與用于微囊化的右旋糖酢-NAD+的 連續(xù)再循環(huán)的可溶的右旋糖酢-NAD+的尼龍聚乙締亞胺微膠囊（Nylonpolyet的Ieneimine microcapsulesforimmobilizingmultienzymeswithsolubledextran-NAD+forthe continuousrecyclingof化emicroencapsulateddextran-NAD+)"，生物化學(xué)和生物物 理學(xué)研究通訊化iochemandBiophysResComm)，第 81 卷，2 (1978)，第 565-570 頁，披露了 半透尼龍聚乙締亞胺微囊的制備，其包含一種具有酵母乙醇脫氨酶巧CI.I.I.I)和蘋果 酸脫氨酶巧C1. 1. 1. 37)連同可溶的固定化酶右旋糖酢-NAD+的多酶體系。
[0010] 彭色列（Poncelet)等人，"交聯(lián)的聚乙締亞胺膜內(nèi)的微囊化 (Microencapsulationwithincrosslinkedpolyetyleneiminemembranes)"，微囊法雜志 (J.Microencapsulation)，第 11 卷，1 (1994)，第 31-40 頁，披露了一種設(shè)及PEI膜形成的微 囊化技術(shù)，其特別適用于生物催化劑的固定。
[0011] WO97/24177描述了一種具有含酶顆粒的液體洗涂劑濃縮物。運些顆粒具有一種 從縮聚物形成的聚合物殼，并且含有一種核屯、聚合物，其引起當(dāng)該洗涂劑濃縮物在水中稀 釋后該聚合物殼的伸展。還披露了囊化的沉淀的酶類。
[0012] JP-A-63-137996描述了含有囊化材料的液體洗涂劑，其中該囊化可W通過凝聚或 通過IFC聚合進行。JP63-137996中的目的是將一種水溶性或吸水性聚合物包含在該核屯、 內(nèi)，當(dāng)將該洗涂劑放入沖洗水中時該聚合物將充分溶脹W引起囊的破裂，該隨之釋放該核 屯、。
[0013] 不幸的是，與水充分配合W給出所需的高內(nèi)壓力并且因此給出非常不透的殼的充 分的伸展的核屯、聚合物在儲存期間暴露于內(nèi)部液體時將通常具有在儲存期間溶脹的傾向 (并且有伸展該殼的傾向）。因此，如果該聚合物的高溶脹對于實現(xiàn)在沖洗水中的快速釋放 是必不可少的，一些溶脹和一些釋放將發(fā)生在儲存期間的風(fēng)險相當(dāng)大。
[0014] 我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用任何先前所描述用于膠囊化洗涂劑酶的微囊化程序很不容易 實現(xiàn)所需效果。在實踐中，要么該膜通常過于可透W致于無法阻止相對低分子量的酶通過 由該膜提供的高比表面積遷移，要么該膜如此不透而且牢固使得當(dāng)將該濃縮物加入沖洗水 中時不能可靠地釋放該酶。運些方法不能簡單復(fù)制操作W給出所需特性的組合。
[0015] 運些現(xiàn)有技術(shù)參考未能認知基于多支化的多胺（例如，PEI)的微囊用于改進洗涂 劑中的酶儲存穩(wěn)定性，并且同時能夠在洗涂劑應(yīng)用中及時遞送運些酶的有用性。
[0016] 概述
[0017] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種微囊組合物，包括一種含洗涂劑酶的微囊，其中該 微囊的膜通過一種多支化的多胺的交聯(lián)而產(chǎn)生。
[0018] 在第二方面，本發(fā)明提供了一種液體洗涂劑組合物，包含表面活性劑和洗涂劑助 洗劑，W至少3%的總濃度，和含洗涂劑酶的微囊，其中該微囊的膜通過多支化的多胺的交 聯(lián)而產(chǎn)生。
[0019] 在另一個方面中，本發(fā)明提供了一種微囊用于改進洗涂劑酶在液體洗涂劑組合物 中穩(wěn)定性的用途，其中該洗涂劑組合物包含表面活性劑和洗涂劑助洗劑，W至少3%的總濃 度，并且其中該微囊通過多支化的多胺的交聯(lián)而產(chǎn)生，并且其中根據(jù)實例2中的方法活性 損失降低至少10%，并且其中根據(jù)實例3中的方法該微囊能夠在3分鐘之內(nèi)釋放至少50% 的酶。
[0020] 本發(fā)明的其他方面和實施例在說明書和實例下是顯而易見的。
[00川詳細說明
[0022] 本發(fā)明的諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一種具有通過多支化的多胺的交聯(lián)而制成的膜的 微囊特別有用于穩(wěn)定液體洗涂劑組合物（例如，衣物或（自動）餐具洗涂洗涂劑）中的洗 涂劑酶。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，該微囊的膜能夠改進在液體洗涂劑組合物中的該或運些囊化的酶 的儲存穩(wěn)定性（與非囊化的酶相比），如在實例2中所展示的。通過交聯(lián)多支化的多胺形成 的膜能夠?qū)⒃撁概c該洗涂劑中的（陰離子）表面活性劑中分離，已知其對酶的穩(wěn)定性是有 害的。
[0023] 當(dāng)在洗涂劑中使用囊化的酶時，一個至關(guān)重要的參數(shù)是當(dāng)該洗涂劑在水中稀釋時 立即釋放該酶的能力，如例如在洗衣或餐具洗涂應(yīng)用中。本發(fā)明的微囊在此方面具有優(yōu)異 性能，并且能夠在一分鐘內(nèi)釋放整個囊化的酶，如在實例3中所展示的。
[0024] 如描述于本發(fā)明的微囊不需要核屯、聚合物的存在W能夠在水中稀釋時釋放該酶。 此外，本發(fā)明不需要該酶在微囊的核屯、中處于一種沉淀的形式用于控制過早釋放，如在WO 97/24177中所述的。
[00巧]我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將酶包封在本發(fā)明具有半透膜的微囊中，并且在運些囊（在添加 至該液體洗涂劑之前）中具有高于該液體洗涂劑中的水活度時，當(dāng)被添加到該洗涂劑（水 正溢出）中時運些囊將經(jīng)歷（部分地）崩潰，因此在運些囊中留下更為濃縮的并且更粘的 含酶內(nèi)部。該膜的崩潰還可導(dǎo)致可透性的降低。運可W通過添加穩(wěn)定劑/聚合物進一步使 用，尤其是不會通過該膜可透的那些。該崩潰和所得黏度增加將降低/妨礙敵對組分（例 如，表面活性劑或馨合劑）擴散進入運些囊中，并且因此增加液體洗涂劑中酶的儲存穩(wěn)定 性。該液體洗涂劑中的對該酶敏感的組分（例如，充當(dāng)該酶底物的組分）還被保護免于受 該酶的降解。在洗涂過程中，該液體洗涂劑被水稀釋，因此增加了水活度。水現(xiàn)在將擴散進 運些囊（滲透作用）中。運些囊將溶脹并且該膜將變得對該酶可透過由此它們可W離開運 些囊，或簡單地脹裂并且W此方式釋放該酶。該概念在穩(wěn)定運些酶對抗液體洗涂劑中的敵 對組分方面非常有效，反之亦然還保護該液體洗涂劑中酶敏感的組分不受酶的影響。
[0026] 對酶敏感并且可W被酶降解的洗涂劑組分的實例包括（括號中的相關(guān)酶）：黃原 膠（黃原膠酶）、具有醋鍵的聚合物（脂肪酶）、氨化藍麻油（脂肪酶）、香料（脂肪酶）、甲 醋橫酸鹽表面活性劑（脂肪酶）、纖維素和纖維素衍生物（例如，CMC)(纖維素酶）、和糊精 和環(huán)糊精（淀粉酶）。
[0027] 敏感的洗涂劑成分還可W被囊化，并且由此被穩(wěn)定化在本發(fā)明的微囊中。敏感的 洗涂劑成分在儲存期間易于降解。運類洗涂劑成分包括漂白化合物、漂白活化劑、香料、聚 合物、助洗劑、表面活性劑等。
[0028] 通常，本發(fā)明的微囊可W被用于分離洗涂劑中不相容的組分/化合物。
[0029] 將運些微囊添加到洗涂劑中可W被用于影響該洗涂劑產(chǎn)品的可視外觀，例如不透 光效應(yīng)（小型微囊）或明顯可見的顆粒（大型微囊）的效應(yīng)。運些微囊也可W是著色的。
[0030] 運些微囊可W被用于在處理和加工酶產(chǎn)品期間降低酶塵埃水平。
[0031] 除非另外指明，貫穿本申請所有的百分比指示為重量百分比（％w/w)。
[003? 微囊
[0033] 典型地，運些微囊通過將水滴形成不可與水混溶的連續(xù)體而產(chǎn)生-即典型地通過 制備一種油包水乳劑-并且隨后通過界面聚合經(jīng)由添加一種交聯(lián)劑形成該膜。在最終固化 之后，可W收獲運些囊并進行進一步清洗并通過本領(lǐng)域已知的方法進行配制。隨后將該囊 配制品加入該洗涂劑中。
[0034] 有效負載、有待囊化的主膜成分和最終另外的組分是在水相中發(fā)現(xiàn)的。在該連續(xù) 體中發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定化運些水滴趨向凝聚的組分（乳化劑、乳化穩(wěn)定劑、表面活性劑等），并且 還通過該連續(xù)體添加該交聯(lián)劑。
[0035] 可W通過本領(lǐng)域中已知的任何方法來制備該乳劑，例如，通過機械攬動、滴注方 法、膜乳化、微流體技術(shù)、超聲處理等。在一些情況下，運些相的簡單混合將自動導(dǎo)致一種乳 劑，通常被稱為自乳化。使用方法導(dǎo)致一個窄的粒度分布是有利的。
[0036] 隨后典型地將該或運些交聯(lián)劑加入該乳劑中，運是直接或更典型地通過制備交聯(lián) 劑在一種溶劑中的溶液，該溶劑在連續(xù)相中是可溶的。該乳劑和交聯(lián)劑或其溶液可W通過 本領(lǐng)域中常規(guī)使用的方法來混合，例如，通過簡單混合或通過仔細地控制該乳劑W及該交 聯(lián)劑溶液流動通過一個串聯(lián)混合器。
[0037] 在一些情況下，需要固化運些囊來完成膜的形成。固化經(jīng)常是簡單的攬拌運些囊 一段時間W允許界面聚合反應(yīng)結(jié)束。在其他情況下，該膜的形成可W通過添加反應(yīng)澤滅劑 來終止。
[0038] 運些囊可W被后修飾，例如通過使組分反應(yīng)到該膜上W阻礙或減少運些顆粒在如 在WO99/01534中所述的洗涂劑中的絮凝。
[0039] 可W通過本領(lǐng)域中已知的方法分離或濃縮運些產(chǎn)生的囊，例如，通過過濾、離屯、、 蒸饋或傾析該囊分散體。
[0040] 運些所得囊可W被進一步配制，例如，通過添加表面活性劑W賦予產(chǎn)物對于存儲、 運輸和稍后處理W及添加至洗涂劑的所需性質(zhì)。其他微囊配制劑包括流變改性劑、殺生物 劑（例如，Proxel)、用于抑調(diào)節(jié)的酸/堿（其也將在運些微囊內(nèi)調(diào)節(jié)）、W及用于調(diào)節(jié)水 活度的水。
[0041] 該囊形成方法可W包括W下步驟：
[0042]-制備初始的一個或多個水相和油相，
[0043]-形成油包水乳劑，
[0044]-通過界面聚合形成膜，
[004引-任選的后修飾，
[0046] -任選的分離和/或配制，
[0047]-添加至洗涂劑。
[0048] 該方法可W是一個分批法或是一個連續(xù)或半連續(xù)方法。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的微囊是小型的水性球體，其周圍有一個均勻的膜。該微囊內(nèi)部的材 料被稱為核屯、、內(nèi)相、或填充物，而該膜有時被稱為殼、包衣、或壁。本發(fā)明的運些微囊具有 在0.5ym和2毫米之間的直徑。優(yōu)選地，運些微囊的平均直徑是在Iym至1000 ym的范 圍中，更優(yōu)選地在5Jim至500Jim的范圍中，甚至更優(yōu)選地在10Jim至500Jim的范圍中，甚 至更優(yōu)選地在50Jim至500Jim的范圍中，并且最優(yōu)選地在50Jim至200Jim的范圍中?？?替代地，運些微囊的直徑是在0. 5Jim至30Jim的范圍中；或在1Jim至25Jim的范圍中。該 微囊的直徑是當(dāng)聚合作用完成之后在油相中測定的。該囊的直徑可W根據(jù)周圍化學(xué)環(huán)境的 水活度改變。
[0050] 酶的微囊化（如本發(fā)明中所用的）可W通過界面聚合來進行，其中聚合反應(yīng)中的 運兩種反應(yīng)物在一個界面處相遇并且快速反應(yīng)。運一方法的基礎(chǔ)是多胺與酸衍生物的反 應(yīng)，通常是酸性面化物，充當(dāng)一種交聯(lián)劑。該多胺優(yōu)選地是基本上水溶性的（當(dāng)處于游離堿 形式時）。在正確的條件下，柔性薄膜在該界面處快速形成。進行該聚合作用的一種方式 是使用該酶和多胺的一種水性溶液，其與一種非水溶劑（W及一種乳化劑）進行乳化，并添 加包含該酸衍生物的溶液。該酶溶液中可W存在堿劑W中和在該反應(yīng)過程中形成的酸。聚 合物（聚酷胺）膜在運些乳滴的界面處立即形成。該微囊的聚合物膜典型地具有陽離子性 質(zhì)，并且因此與具有陰離子性質(zhì)的化合物結(jié)合/絡(luò)合。
[0051]運些微囊的直徑是通過運些乳滴的大小而確定的，乳滴的大小通過例如攬拌速率 來控制。
[0052]到,劑
[0053]乳劑是一個液相在第二液相內(nèi)暫時或永久的分散體。該第二液相通常被稱為連續(xù) 相。表面活性劑通常用于幫助乳劑的形成和穩(wěn)定。不是所有的表面活性劑都能同樣地穩(wěn)定 乳劑。需要針對最優(yōu)乳劑效用選擇表面活性劑的類型和數(shù)量，尤其是對于該乳劑的制備和 物理穩(wěn)定性，W及在稀釋或進一步加工過程中的穩(wěn)定性。物理穩(wěn)定性是指將乳劑W分散體 形式進行維持。例如凝聚、聚合、吸附至容器壁、沉降和乳油化的過程是物理不穩(wěn)定性的多 種形式，并且應(yīng)被避免。合適的表面活性劑的實例描述于WO97/24177,第19-21頁；W及 WO99/015：34 中。
[0054]可W將乳劑進一步分類為簡單的乳劑，其中該分散的液相是一種簡單的均質(zhì)液 體，或一種更復(fù)雜的乳劑，其中該分散的液相是液相或固相的非均質(zhì)組合，例如雙重乳劑或 復(fù)合型乳劑。例如，可W形成一種油包水雙重乳劑或復(fù)合型乳劑，其中該水相本身進一步含 有乳化的油相；運種類型的乳劑可W被指定為一種油包水包油（o/w/o)乳劑?？商娲?，可 W形成油包水乳劑，其中該水相含有分散的固相，通常被稱為一種懸浮液-乳劑?？蒞描述 其他更復(fù)雜的乳劑。因為在描述運類系統(tǒng)方面固有的困難，術(shù)語乳劑用于描述簡單和更復(fù) 雜的乳劑兩者，不必要限制乳劑的形式或存在的相類型和相數(shù)。
[00巧]《胺
[0056]膜的剛性/柔性和可透性主要受多胺選擇的影響。根據(jù)本發(fā)明的多胺是一種多支 化的多胺。每個分支（優(yōu)選地W-個伯氨基團結(jié)束）充當(dāng)膜網(wǎng)絡(luò)中的一個系拴點，從而產(chǎn) 生本發(fā)明的有利性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的多支化的多胺是一種具有多于兩個分支點和多于兩個 反應(yīng)性氨基的多胺（能夠與交聯(lián)劑反應(yīng)，即，伯氨基團和仲氨基團）。當(dāng)制備該乳劑時，該多 支化的多胺被用作起始材料-它不是從其他起始材料原位形成的。為了得到本發(fā)明引人 注目的特性，該多胺的多支化結(jié)構(gòu)必須作為起始材料存在。
[0057]分支點數(shù)目和伯胺數(shù)目之間存在密切的關(guān)系，由于伯胺將總是位于分支的末端： 線性胺只能含有兩個伯胺。對于假設(shè)地引入運樣一種線性二胺的每個分支點將允許一個或 多個伯胺引入到該或運些被引入的分支的末端。在本文中，我們將該伯氨基團理解為該分 支的一部分，即該分支的端點。例如，我們認為=(2-氨乙基）胺或1，2, 3-丙烷=胺都是 具有一個分支點的分子。對于本發(fā)明，該多胺具有至少四個伯胺?？蒞從脂肪族控鏈（如 在之前所述實例中）或從不飽和的碳鍵（例如在，例如3, 3'-二氨基聯(lián)苯胺中）、或從叔氨 基團（例如在N，N，N'，N'-四-(2-氨乙基）乙二胺）中引入多個分支點。
[0058]除了分支點的數(shù)目之外，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)性氨基團的緊密度非常重要。例如N，N，N'，N'-四-(12-氨十二基）乙二胺的物質(zhì)是不適合的。膚或蛋白（例如一種酶）都 不適合用于膜形成。因此，該多支化的多胺不是膚或蛋白。
[0059]在一個實施例中，運些反應(yīng)性氨基團構(gòu)成該多支化的多胺至少15%的分子量，例 如超過20%，或超過25%。優(yōu)選地，該多支化的多胺的分子量是至少為IkDa;更優(yōu)選地該 多支化的多胺的分子量是至少為1. 3kDa。
[0060]在一個優(yōu)選的實施例中，該多支化的多胺是聚乙締亞胺（PEI)，及其修飾體，具有 多于兩個分支點和多于兩個反應(yīng)性氨基，其中運些反應(yīng)性氨基構(gòu)成該PEI至少15%的分子 量，例如超過20%，或超過25%。優(yōu)選地，該PEI的分子量是至少為IkDa。
[0061] 不同的多支化的多胺的組合可W用于制備根據(jù)本發(fā)明的微囊。
[0062] 可W通過添加一種或多種具有小于IkDa分子量的小胺來改進本發(fā)明的微囊的有 利特性（例如，酶儲存穩(wěn)定性、降低的酶滲出、降低的洗涂劑成分的入通量）。該小胺優(yōu)選地 是基本上水溶性的（當(dāng)處于游離堿形式時）并且可W是一種例如乙二胺、六亞甲基二胺、己 二胺、二亞乙基四胺、乙四胺、苯二胺、贓嗦、四亞甲基五胺或、優(yōu)選地二亞乙基S胺值ETA) 的物質(zhì)。在制備本發(fā)明的微囊時，可W按小胺和多支化的多胺的總含量重量計高達50 %、優(yōu) 選地高達40 %、高達30 %、高達20 %、高達10 %、高達5 %的量添加運些小胺。
[0063] 香聯(lián)劑
[0064] 如在本發(fā)明中所使用的交聯(lián)劑是一種具有至少兩個能夠與胺類反應(yīng)形成共價鍵 的基團/位點的分子。
[0065] 該交聯(lián)劑優(yōu)選地是油可溶性的并且可W呈酸酢或酸性面化物的形式，優(yōu)選地為酷 基氯。例如，它可W是己二酷氯、癸二酷氯、十二烷基二酷氯、鄰苯二甲酯氯、對苯二甲酯氯、 間苯二甲酯氯、或均苯=甲酯氯，但優(yōu)選地，該交聯(lián)劑是對苯二甲酯氯或均苯=甲酯氯。
[006