針對間質(zhì)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的循環(huán)腫瘤細胞的特異性檢測工具的制作方法
【專利說明】針對間質(zhì)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的循環(huán)腫瘤細胞的特異性檢測 工具
[0001] 本申請要求2013年3月5日提交的美國臨時申請?zhí)?1/772, 973的優(yōu)先權(quán)權(quán)益， 所述美國臨時申請的整個內(nèi)容以引用的方式并入本文。
[0002] 文件名稱"UTFCP1208TO_ST25. txt"中包含的 3KB (如 Microsoft Windows 中所測 量）且于2014年2月18日創(chuàng)建的序列表通過電子提交與此一起提交，并且以引用的方式 并入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 本發(fā)明根據(jù)由國立衛(wèi)生研究院授予的資助號CA120295在政府資助下進行。政府 享有本發(fā)明的某些權(quán)利。 1.發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明大體上涉及癌癥生物學(xué)的領(lǐng)域。更具體來說，它涉及計數(shù)和分離循環(huán)腫瘤 細胞以有助于早期檢測腫瘤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。
[0006] 2.相關(guān)技術(shù)的描述
[0007] 轉(zhuǎn)移是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。循環(huán)腫瘤細胞（CTC)被視為轉(zhuǎn)移的種子，并且 被定義為使它們自身從原發(fā)性腫瘤脫離進入血流中，并且朝向遠端器官行進以定殖成轉(zhuǎn)移 瘤的罕見細胞（Pantel和Brakenh off, 2004)。盡管在癌癥療法領(lǐng)域的近期進步能夠牽制 原發(fā)性癌癥散布，但需要用于早期檢測、診斷和治療性監(jiān)測轉(zhuǎn)移性癌癥的可靠生物標(biāo)志物。 癌癥患者的外周血液中存在的CTC正作為用于早期檢測和監(jiān)測抗癌藥物的治療功效的有 前途靶標(biāo)而出現(xiàn)（Parkinson等，2012)。目前，用于檢測CTC的可接受標(biāo)志物包括EpCAM 和細胞角蛋白（Parkinson等，2012)。然而，這些標(biāo)志物可檢測僅上皮CTC，從而排除已喪 失EpCAM的表達的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的（EMT) CTC (Sieuwerts等，2009)和源于間質(zhì)腫瘤的任 何其它非上皮CTC，所述間質(zhì)腫瘤構(gòu)成成人癌癥類型的約10%以及兒科癌癥類型的約20% (Mackall等，2002)。當(dāng)前檢測工具的這個局限性表明急切需要可滿足這些要求的新穎工 具。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種用于檢測循環(huán)腫瘤細胞上的細胞表面波形蛋 白的新穎抗體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的單克隆抗體，其中所述抗體特異 性結(jié)合波形蛋白多肽，并且其中所述抗體與84-1單克隆抗體競爭結(jié)合所述多肽。在某些方 面，本發(fā)明的單克隆抗體可與84-1單克隆抗體結(jié)合相同表位。
[0010] 在一個方面，本發(fā)明的單克隆抗體可包含與84-1的Vh⑶Rl (SEQ ID NO: 3)至少 80% 同一的第一 Vh CDR;與 84-1 的 Vh CDR2(SEQ ID N0:4)至少 80% 同一的第二 Vh CDR; 與 84-1 的 Vh CDR3(SEQ ID N0:5)至少 80% 同一的第三 Vh CDR;與 84-1的\ CDR1(SEQ ID N0:6)至少 80% 同一的第一 \ CDR;與 84-1 的\ CDR2(SEQ ID N0:7)至少 80% 同一的第 二\ CDR;和與 84-1 的\ CDR3(SEQ ID N0:8)至少 80% 同一的第三\ CDR。
[0011] 在另一方面，本發(fā)明的單克隆抗體可包括與SEQ ID NO: 3同一的第一 Vh⑶R ;與 SEQ ID NO: 4 同一的第二 Vh CDR ;與 SEQ ID NO: 5 同一的第三 Vh CDR ;與 SEQ ID NO: 6 同一 的第一\CDR;與SEQIDN0:7同一的第二\CDR;和與SEQIDN0:8同一的第三\CDR。
[0012] 在另一方面，本發(fā)明的單克隆抗體可包含與84-1的Vh結(jié)構(gòu)域（SEQ ID NO: 1)至 少約80%同一的Vh結(jié)構(gòu)域和與84-1的V1結(jié)構(gòu)域（SEQ ID NO: 2)至少約80%同一的V #吉 構(gòu)域。在某一方面，本發(fā)明的單克隆抗體可包含與84-1的Vh結(jié)構(gòu)域（SEQ ID NO: 1)同一 的Vh結(jié)構(gòu)域和與84-1的V1結(jié)構(gòu)域（SEQ ID NO:2)同一的V1結(jié)構(gòu)域。在另外某一方面，本 發(fā)明的單克隆抗體可為84-1抗體。
[0013] 在一些方面，本文公開的單克隆抗體可為重組的。在一些方面，實施方案的單克隆 抗體可為IgG、IgM、IgA或其抗原結(jié)合片段。在一些方面，本發(fā)明的單克隆抗體可為Fab'、 F((ab'）2、F((ab'）3、單價scFv、二價scFV或單結(jié)構(gòu)域抗體。在一些方面，本文單克隆抗 體可為人抗體、人源化抗體或去免疫抗體。在某些方面，所述人源化或去免疫抗體可在人 IgG (例如IgGl或IgG2)骨架上包含前述CDR。
[0014] 在某些方面，實施方案的單克隆抗體可綴合于顯像劑、化學(xué)治療劑、毒素或放射性 核素。在某些方面，本文公開的單克隆抗體可包含在藥學(xué)上可接受的載體中。
[0015] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸分子，其包含編碼本發(fā)明的 單克隆抗體的核酸序列。
[0016] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種重組多肽，其包含含有84-1的Vh結(jié)構(gòu)域的 ⑶R 1-3(SEQ ID N0:3、4和5)的抗體Vh結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種重組 多肽，其包含含有84-1的\結(jié)構(gòu)域的CDR 1-3 (SEQ ID N0:6、7和8)的抗體V ^結(jié)構(gòu)域。在 另一實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸分子，其包含編碼包含含有84-1的Vh結(jié) 構(gòu)域的CDR 1-3 (SEQ ID NO: 3、4和5)的抗體Vh結(jié)構(gòu)域和/或含有84-1的八結(jié)構(gòu)域的CDR 1-3(SEQ ID N0:6、7和8)的抗體\結(jié)構(gòu)域的多肽的核酸序列。
[0017] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種宿主細胞，其包含一種或多種編碼實施方案 的單克隆抗體或重組蛋白的多核苷酸分子。在某些方面，宿主細胞可為哺乳動物細胞、酵母 細胞、細菌細胞、纖毛蟲細胞或昆蟲細胞。
[0018] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗體的方法，其包括在細胞中表達一種 或多種編碼本發(fā)明的抗體的\和V H多肽鏈的多核苷酸分子，以及從所述細胞純化所述抗 體。
[0019] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種分離的抗體，其中所述抗體包含與84-1的VhCDR1(SEQ ID N0:3)至少 80% 同一的第一 Vh CDR;與 84-1 的 Vh CDR2(SEQ ID N0:4)至少 80% 同一的第二 Vh CDR;與 84-1 的 Vh CDR3(SEQ ID N0:5)至少 80% 同一的第三 Vh CDR; 與 84-1的\ CDR1(SEQ ID N0:6)至少 80% 同一的第一 \ CDR;與 84-1的\ CDR2(SEQ ID N0:7)至少 80% 同一的第二\ CDR;和與 84-1 的\ CDR3(SEQ ID N0:8)至少 80% 同一的 第三\ CDR。
[0020] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種特異性檢測循環(huán)腫瘤細胞的方法，其包括（a) 從患者獲得血液樣品，（b)使所述樣品與結(jié)合細胞表面波形蛋白的抗體一起孵育，以及（C) 檢測所述抗體結(jié)合的細胞。在某些方面，結(jié)合細胞表面波形蛋白的抗體可為本文公開的抗 體。在一些方面，抗體可為結(jié)合細胞表面波形蛋白的抗體樣分子，如適體。在一些方面，檢 測抗體結(jié)合的細胞可包括使用流式細胞計量術(shù)、免疫組織化學(xué)、熒光顯微術(shù)、放射免疫測定 或 ELISA。
[0021] 在某些方面，方法可進一步包括在使樣品與結(jié)合細胞表面波形蛋白的抗體一起孵 育之前清除樣品的CD45陽性細胞。在某些方面，方法可進一步包括通過使樣品與蛋白質(zhì) 酪氨酸磷酸酶抑制劑一起孵育來增加細胞表面波形蛋白表達水平。在一些方面，蛋白質(zhì)酪 氨酸磷酸酶抑制劑是原釩酸鈉。在其它方面，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶抑制劑可為迪憐他汀 (dephostatin)、mpV(pic)、苯胂氧化物、葡萄糖酸鋪鈉 、BAY U6751、酪氨酸磷酸酶抑制劑混 合物（包括釩酸鈉、鉬酸鈉、酒石酸鈉和咪唑）或RK-682。
[0022] 在某些方面，方法可進一步限定為一種分離活循環(huán)腫瘤細胞的方法，并且進一步 包括從樣品分離（c)的抗體結(jié)合的循環(huán)腫瘤細胞。在一些方面，分離可包括免疫磁性捕集、 基于粘附的細胞分選、磁性激活細胞分選或熒光激活細胞分選（FACS)。在某些方面，方法可 進一步包括為所分離的活循環(huán)腫瘤細胞基因分型。
[0023] 在某些方面，方法可進一步包括使樣品與EpCAM或細胞角蛋白抗體一起孵育。在 某些方面，方法可進一步包括定量患者中循環(huán)腫瘤細胞的數(shù)目。在某些方面，血液樣品來自 先前尚未被診斷有癌癥的患者，并且方法是早期癌癥檢測的方法。在另一方面，血液樣品來 自處于緩解中的患者，并且方法是檢測復(fù)發(fā)的方法。在一些方面，每毫升血液檢測到至少約 3個循環(huán)腫瘤細胞指示患者具有腫瘤。在其它方面，每毫升血液檢測到至少約1個或至少約 2個循環(huán)腫瘤細胞指示患者具有腫瘤。
[0024] 在某些方面，方法可為監(jiān)測癌癥患者中對療法的響應(yīng)的方法，其中如果循環(huán)腫瘤 細胞的數(shù)目隨時間降低，那么所述患者被稱為已對療法具有積極響應(yīng)。在某些方面，方法可 為預(yù)測方法，其中每毫升血液檢測到至少約5個循環(huán)腫瘤細胞指示患者具有不良預(yù)后。在 其它方面，方法可為預(yù)測方法，其中每毫升血液檢測到至少約1個、至少約2個、至少約3個 或至少約4個循環(huán)腫瘤細胞指示患者具有不良預(yù)后。
[0025] 在某些方面，患者可具有上皮腫瘤。在其它方面，患者可具有間質(zhì)腫瘤。在某些方 面，腫瘤可包括乳腺癌、肺癌、頭頸癌、前列腺癌、食道癌、氣管癌、皮膚癌、腦癌、肝癌、膀胱 癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、睪丸癌、結(jié)腸癌、直腸癌或皮膚癌。在某些方 面，腫瘤可包括骨肉瘤、血管肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤因肉瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、成神 經(jīng)細胞瘤和白血病。
[0026] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療根據(jù)本發(fā)明方法確定具有循環(huán)腫瘤細胞 的患者的方法，所述方法包括施用有效量的本文公開的綴合抗體。在一些方面，綴合抗體可 包含在藥學(xué)上可接受的組合物中。
[0027] 在一個方面，抗體可被全身性施用。在其它方面，抗體可被靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、腫瘤內(nèi)、 肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或局部施用。方法可進一步包括向受試者施用至少第二抗癌療法。第 二抗癌療法的實例包括但不限于手術(shù)療法、化學(xué)療法、放射療法、冷凍療法、激素療法、免疫 療法或細胞因子療法。
[0028] 在其它方面，方法可進一步包括向受試者施用本發(fā)明組合物超過一次，例如像1、 2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 或大于 20 次。
[0029] 在一個實施方案中，提供一種用于治療受試者的癌癥的包含本發(fā)明實施方案的抗 體的組合物。受試者可已根據(jù)本發(fā)明實施方案的方法確定具有循環(huán)腫瘤細胞。在一些方面， 受試者可為人。在一些方面，受試者可為非人哺乳動物。在一些方面，組合物可為藥學(xué)上可 接受的組合物。
[0030] 在某些方面，受試者可具有上皮腫瘤。在其它方面，受試者可具有間質(zhì)腫瘤。在其 它方面，受試者可具有轉(zhuǎn)移性腫瘤。在某些方面，腫瘤可包括乳腺癌、肺癌、頭頸癌、前列腺 癌、食道癌、氣管癌、皮膚癌、腦癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、 睪丸癌、結(jié)腸癌、直腸癌或皮膚癌。在某些方面，腫瘤可包括骨肉瘤、血管肉瘤、橫紋肌肉瘤、 平滑肌肉瘤、尤因肉瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤和白血病。
[0031] 在一些方面，組合物可進一步包含至少一種其它抗癌劑，如化學(xué)治療劑、放射冶療 劑、基因療法或第二免疫治療劑。在一些方面，組合物可被配制以供全身性、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、 腫瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或局部施用。
[0032] 在一個實施方案中，本文提供本發(fā)明實施方案的抗體生產(chǎn)用于治療受試者的癌癥 的藥劑的用途，其中所述受試者已被確定包含循環(huán)腫瘤細胞。
[0033] 某些實施方案涉及一種抗體或重組多肽組合物，其包含特異性結(jié)合細胞表面波形 蛋白的分離的和/或重組抗體或多肽。在某些方面，抗體或多肽具有與任何本文提供的單 克隆抗體的全部或一部分至少或至多80、85、90、95、96、97、98、99或100%同一（或其中可 導(dǎo)出的任何范圍）的序列。在其它方面，分離的和/或重組抗體或多肽具有、具有至少、或 具有至多 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 或大于 100 個來自任何本 文提供的序列或所述序列的組合的連續(xù)氨基酸。
[0034] 在其它方面，實施方案的抗體或多肽包含一個或多個具有任何本文公開的氨基酸 序列的氨基酸區(qū)段。舉例來說，抗體或多肽可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10個氨基 酸區(qū)段，所述區(qū)段在長度方面包含約、至少或至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25to 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、 151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、 170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、 189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199 或 200 個氨基酸，包括介于之間的所有 值和范圍，所述氨基酸與任何本文公開的氨基酸序列至少80、85、90、95、96、97、98、99或 100%同一。在某些方面，氨基區(qū)段選自如表7中提供的細胞表面波形蛋白結(jié)合抗體的氨基 酸序列中的一個。
[0035] 在其它方面，實施方案的抗體或多肽包含具有任何本文公開的氨基酸序列的氨 基酸區(qū)段，其中所述區(qū)段在本文提供的任何序列中的氨基酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 至 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、 165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199 或 200 處開始， 并且在同一提供的序列中的氨基酸位置4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25 至 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、 171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200處結(jié)束。在某些方面