組合，如將為本領域普通技術(shù)人員所知。根據(jù)熟知參數(shù)調(diào)整 PH和藥物組合物中各種組分的精確濃度。藥學上可接受的載體被特別配制以向人施用，但 在某些實施方案中，可合乎需要的是使用被配制以向非人動物施用，但將不可為向人施用 所接受（例如由于政府規(guī)章）的藥學上可接受的載體。除非任何常規(guī)載體與活性成分不相 容，否則預期它用于治療性組合物或藥物組合物中。
[0101] 術(shù)語"單位劑量"或"劑量"是指適用于受試者中的物理離散單元，各單元含有被 計算以產(chǎn)生以上聯(lián)合它的施用（即適當途徑和治療方案）所討論的所需響應的預定量的治 療性組合物。待施用的量（即根據(jù)治療次數(shù)的量與單位劑量兩者）取決于所需作用。向患 者或受試者施用的本發(fā)明組合物的實際劑量可由身體和生理因素決定，所述因素如受試者 的體重、年齡、健康狀況和性別、所治療的疾病的類型、疾病滲透的程度、先前或并行治療干 預、患者的特發(fā)病、施用途徑、以及特定治療性物質(zhì)的效價、穩(wěn)定性和毒性。舉例來說，劑量 也可包括每次施用每kg體重約1 μ g至約1000 mg(這個所述范圍包括間插劑量）或大于 lOOOmg，以及其中可導出的任何范圍。在可從本文所列的數(shù)值導出的范圍的非限制性實例 中，可施用每kg體重約5 μ g至約100mg、約5 μ g至約500mg等的范圍。負責施用的從業(yè)者 將在任何情況下確定組合物中活性成分的濃度和適于個別受試者的劑量。
[0102] 活性化合物可被配制供胃腸外施用，例如配制供通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或甚至 腹膜內(nèi)途徑注射。通常，所述組合物可被制備成液體溶液或混懸液；也可制備適用于在注射 之前在添加液體后制備溶液或混懸液的固體形式；并且制劑也可被乳化。
[0103] 適于可注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或丙 二醇水溶液的制劑；和用于即時制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉劑。在所有情況下， 形式都必須無菌，并且就它可易于注射而言必須是流體。它在生產(chǎn)和儲存條件下也應是穩(wěn) 定的，并且必須防止如細菌和真菌的微生物的污染作用。
[0104] 蛋白質(zhì)組合物可被配制成中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽（用蛋 白質(zhì)的游離氨基形成），并且其用無機酸（例如像鹽酸或磷酸）或如乙酸、草酸、酒石酸、杏 仁酸等的有機酸形成。用游離羧基形成的鹽也可源于無機堿，例如像氫氧化鈉、氫氧化鉀、 氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；以及如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等的有機堿。
[0105] 藥物組合物可包括溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙 二醇和液體聚乙二醇等）、其適合混合物和植物油。適當流動性可例如通過使用包覆劑（如 卵磷脂），在分散液的情況下通過維持所需粒徑，以及通過使用表面活性劑加以維持。防止 微生物作用可通過各種抗細菌和抗真菌劑（例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、 硫柳汞等）來達成。在許多情況下，將優(yōu)選的是包括等張劑，例如糖或氯化鈉。延長可注射 組合物的吸收可通過在組合物中使用延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠來達成。
[0106] B.組合治療
[0107] 在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法涉及與第二或另一療法組合的選擇性 結(jié)合CTC的針對細胞表面波形蛋白的抗體或抗體片段。所述療法可應用于治療與CTC相關(guān) 的任何疾病。
[0108] 方法和組合物（包括組合療法）增強治療或保護作用，和/或增加另一抗癌或抗 過度增生療法的治療作用。治療性和防治性方法和組合物可以有效實現(xiàn)所需作用，如殺滅 CTC和/或防止轉(zhuǎn)移的組合量提供。這個過程可涉及使細胞與抗體或抗體片段和第二療法 兩者接觸?？墒菇M織、腫瘤或細胞與一種或多種包含一種或多種藥劑（即抗體或抗體片段 或抗癌劑）的組合物或藥理學制劑接觸，或通過使所述組織、腫瘤和/或細胞與兩種或更多 種不同組合物或制劑接觸，其中一種組合物提供1)抗體或抗體片段，2)抗癌劑，或3)抗體 或抗體片段與抗癌劑兩者。此外，預期所述組合療法可連同化學療法、放射療法、手術(shù)療法 或免疫療法一起使用。
[0109] 術(shù)語"接觸"和"暴露"在應用于細胞時在本文中用于描述治療性構(gòu)建體和化學治 療劑或放射冶療劑被遞送至靶標細胞中或被與所述靶標細胞直接鄰近放置所依的過程。為 實現(xiàn)細胞殺滅，例如以有效殺滅細胞或防止它分裂的組合量向細胞遞送兩種藥劑。
[0110] 相對于抗癌治療，抗細胞表面波形蛋白抗體可在之前、期間、之后或以各種組合施 用。施用可處于在并行至數(shù)分鐘至數(shù)天至數(shù)周的范圍內(nèi)的間隔下。在其中抗體或抗體片段 與抗癌劑分開向患者提供的實施方案中，將通常確保有效時期在各次遞送的時間之間不期 滿，以使兩種化合物將仍然能夠?qū)颊呤┘佑欣M合作用。在所述情況下，預期可在彼此的 約12至24或72小時內(nèi)，并且更具體來說在彼此的約6-12小時內(nèi)提供患者以抗體療法和 抗癌療法。在一些情況下，可合乎需要的是顯著延長治療時期，其中在相應施用之間有數(shù)天 (2、3、4、5、6 或 7)至數(shù)周（1、2、3、4、5、6、7或8)時間推移。
[0111] 在某些實施方案中，療程將持續(xù)1-90天或大于90天（這個所述范圍包括間插天 數(shù)）。預期一種藥劑可在第1天至第90天（這個所述范圍包括間插天數(shù)）中的任一天或 其任何組合給與，并且另一藥劑在第1天至第90天（這個所述范圍包括間插天數(shù)）中的任 一天或其任何組合給與。在單一天（24小時時期）內(nèi)，患者可被給與一次或多次藥劑施用。 此外，在療程之后，預期存在一段不施用抗癌治療的時期。視患者的狀況，如它們的預后、力 量、健康狀況等而定，這個時期可持續(xù)1-7天和/或1-5周和/或1-12個月或大于12個月 (這個所述范圍包括間插天數(shù)）。預期必要時將重復治療循環(huán)。
[0112] 可采用各種組合。對于以下實施例，抗體療法是"A"，而抗癌療法是"B" ：
[0113] A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
[0114] B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
[0115] B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
[0116] 向患者施用本發(fā)明的任何化合物或療法都將在考慮藥劑的毒性（如果有的話）下 遵循用于施用所述化合物的一般性方案。因此，在一些實施方案中，存在監(jiān)測可歸因于組合 療法的毒性的步驟。 IV.實施例
[0117] 包括以下實施例以說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領域技術(shù)人員應了解隨后實施 例中公開的技術(shù)代表由本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)在實施本發(fā)明方面良好地起作用的技術(shù)，并且因此可 被視為構(gòu)成它的優(yōu)選實施模式。然而，根據(jù)本公開，本領域技術(shù)人員應了解可在不脫離本發(fā) 明的精神和范圍下，在所公開的特定實施方案中進行許多改變，并且仍然會獲得相似或類 似結(jié)果。
[0118] 實施例1 -材料和方法
[0119] 細胞系。DLD-I、GEO 和 HUVEC 細胞從 Lee Ellis 博士（MD Anderson Cancer Center)獲得。LM7、SAOS-2、K7、K7M3、LM-8 和 DUNN 細胞由 Eugenie S Kleinerman 博士 (MD Anderson Cancer Center)友情提供。！105、]\^-263、05-0、05-0和05-25細胞由06111118 Hughes 博士（MD Anderson Cancer Center)友情提供。SNU398、HEP3B 和 SNU 449 細胞 由 Lopa Mishra 博士（MD Anderson Cancer Center)友情提供。SKNAS、SKNBE2、SK-N_SH、 NGP、CHP134、SH-SY5Y、LAN5 和 KCN 細胞由 Patrick Zweidler-McKay 博士（MD Anderson Cancer Center)友情提供。用于這個研究中的所有其它細胞系都從美國典型培養(yǎng)物保藏 中心（ATCC) (Manassas，VA，USA)獲得。來自骨肉瘤患者的原發(fā)性細胞培養(yǎng)物由Dina Lev 博士（MD Anderson Cancer Center)友情提供。根據(jù)ATCC推薦使所有細胞系生長。使 無特定推薦的細胞系在具有10%胎牛血清（FBS) (Gibco, Invitrogen)、1 % L-谷氨酰胺 (Gibco, Invitrogen)和 0· 1 % 青霉素 / 鏈霉素（Gibco, Invitrogen)的 DMEM-F12 (Sigma Aldrich)中生長。除非直至指定，否則所有細胞都在37°C下于5% C0J?育器中維持。在 具有 10%熱失活 FBS、1% L-谷氨酰胺、100yg/mL Primocin(Invivogen)和 0· 1%青霉素 /鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)從人結(jié)腸癌、肝癌、肺癌和骨癌獲得的原發(fā)性培養(yǎng)物。
[0120] 在纖維結(jié)合蛋白涂布的板（Thermo Fisher)上于具有10 %熱失活血清 (Invitrogen)并補充有生長因子的DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)使用84-1抗體分離的CTC。 在補充10ng/mL人表皮生長因子（hEGF) (Cell Signaling)和胰島素生長因子（hIGF) (R&D Systems)下培養(yǎng)從骨肉瘤患者分離的CTC。在補充10ng/mL人EGF、IGF和堿性成纖細胞生 長因子（hFGF2)下培養(yǎng)從結(jié)腸癌和肝患者分離的CTC。在以上提及的具有表皮生長因子、胰 島素生長因子和成纖細胞生長因子（Cell Signaling)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)從犬和小鼠血液分 離的CTC。每四天更換一次培養(yǎng)基。所有細胞都在37°C下于5%C0J?育器中維持。
[0121] Geltrex薄層方法。使HPC-I細胞在Geltrex生長因子降低的基底膜基質(zhì) (Invitrogen)上生長，所述基質(zhì)是從Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤純化的可溶性形式的基 底膜，其在37°C下膠凝，從而形成提供細胞培養(yǎng)的基質(zhì)的重構(gòu)基底膜。Geltrex的主要組分 包括各種生長因子和層粘連蛋白（laminin)、膠原蛋白IV、巢蛋白（entactin)。根據(jù)生產(chǎn)商 推薦，在冰上解凍Geltrex，并且100 μ L Geltrex用于在涂鋪細胞之前1小時涂布Lab Tek 腔室載片（Thermo)。稍后，以薄凝膠涂布在腔室載片上涂鋪于100 μ L具有2% Geltrex的 冷無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基中的1000個HPC-I細胞。使細胞在37°C下在含5% CO2的空 氣的含濕氣氛圍中生長，并且通過顯微鏡觀察球體的形成。
[0122] 血液收集和處理。對于小鼠樣品，使用下頌下面頰放血方法從小鼠收集血液，并且 在每周追蹤研究期間在給定時間將200 μ L血液收集在EDTA管（Fisher)中。在研究結(jié)束 時，使用左心室穿刺方法收集至少800 μ L血液。接著根據(jù)生產(chǎn)商推薦，使用RBC溶解緩沖 液（eBioscience)，使收集的血液經(jīng)受RBC溶解。接著于PBS中洗滌細胞，并且用于進一步 分析。
[0123] 根據(jù)IRB方案，在MD Anderson Cancer Center，在知情同意之后獲得供CTC分析 的人血液樣品。使用CPT真空采血管（BD Bioscience)，在任何給定血液抽取時獲得最多 8mL血液。從Gulf Coast血液中心獲得健康血液樣品。根據(jù)生產(chǎn)商推薦分離單核細胞。接 著于PBS中洗滌細胞，并且用于進一步分析。
[0124] 從Gulf Coast獸醫(yī)診所獲得來自犬的血液樣品。選擇提交至Gulf Coast獸醫(yī)診 所的私有狗用于研究。除已在組織學上確認贅生疾病之外，納入準則也包括不存在外顯性 心臟、腎或其它危急生命的疾病。通過獲得徹底既往病史、身體檢查、完全血細胞計數(shù)、血清 生物化學剖析、尿分析、心電圖、胸部放射照片（三視轉(zhuǎn)移檢查）和腹部超聲（如果指示） 來對狗分級。對于腫瘤類型的確認，在麻醉下通過手術(shù)獲得來從原發(fā)性腫瘤的切除活檢體， 并且放置在10 %中性緩沖福爾馬林中。在固定之后，切割組織，用石蠟包埋，切片，粘著于載 片，用蘇木精和曙紅染色，蓋片，并且由委員會認證的獸醫(yī)學病理學家評估。
[0125] 抗體產(chǎn)生。具有6-His的重組人波形蛋白（rhVim) (R&D Systems)用作用于產(chǎn)生抗 體的抗原。使用ELISA測定來測定抗波形蛋白滴度。簡要來說，rhVim用作ELISA中的固體 抗原。在用rhVim涂布的ELISA孔中孵育連續(xù)兩倍稀釋的血清2小時。在洗滌以及與過氧 化物酶偶聯(lián)的抗小鼠 IgG抗體一起孵育之后，進行顯色反應，并且用鄰亞苯基-二胺（OPD) 來分析。在較低稀釋度下顯示較高O.D.的抗體被考慮用于進一步篩選。使選擇用于篩選 的抗體與細胞表面上具有以及不具有波形蛋白的骨肉瘤細胞系一起孵育。選擇并進一步分 析對CSV具有極高親和力的抗體。84-1是可用于以高親和力和靈敏性檢測細胞表面波形蛋 白的最佳克隆。接著通過ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀、免疫細胞化學分析和免疫組織化學 來進一步表征這個抗體的波形蛋白結(jié)合性。也表征抗體12-1對CTC的檢測和分離。
[0126] 84-1陽性細胞選擇。首先在生產(chǎn)商推薦下使用EaSyS印TM人⑶45清除試劑盒來清 除⑶45陽性細胞。其次，使⑶45-ve細胞部分經(jīng)受84-1陽性選擇。簡要來說，細胞用84-1 抗體標記，并且稍后添加小鼠 IgG結(jié)合微珠粒至混合物中。接著使用來自Miltenyi Biotec 的磁性柱提取84-1+ve細胞。從而獲得的細胞是84-1陽性的以及⑶45陰性的，并且準備 好供進一步分析。
[0127] 流式細胞計量術(shù)。通過胰蛋白酶處理來使50萬個細胞脫離，洗滌，并且在冰上在 黑暗中染色20分鐘。對于CSV分析，細胞用84-lmAb (1:100)染色，并且用作小鼠初級抗體 的同種型對照（Invitrogen)。稍后，將細胞于PBS中沖洗兩次，并且使用AlexaFluor-405、 AlexaFluor-488 和 AlexaFluor-555 二級抗體（Invitrogen)進行二級抗體標記。接著于 PBS中洗滌細胞兩次，并且立刻用于使用Attune流式細胞儀（Applied Biosystems)來獲取 數(shù)據(jù)。計數(shù)10至50, 000個細胞以供分析。稍后使用FlowJo軟件（Treestar)分析數(shù)據(jù)。 使用由Flowjo軟件提供的算法測量平均熒光強度，并且稍后評估CSV在表面上的存在?；?者，使用針對CSV的84-1抗體和⑶45抗體，使在RBC溶解之后獲得的細胞經(jīng)受雙重染色。 使用抗體捕集Abc珠粒（Invitrogen)補充樣品。在CSV陽性門控和⑶45陰性門控下繪 制點圖以計數(shù)給定樣品中的CTC。同種型對照用于門控未染色和非特異性染色細胞。使用 Attune流式細胞儀分析整個細胞群體的CTC，并且使用FlowJo軟件進行分析。
[0128] 顯微術(shù)圖像捕集和分析。如上所述使每個腔室總計5, 000個細胞在Lab-Tek 8 孔 permanox 腔室載片（Thermo Scientific, Rochester, NY, USA)上生長。對于細胞表面 染色，使用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，用PBS(pH 7.4)洗滌，于10%胎牛血清（FCS) (Gibco, Invitrogen)中阻斷1小時，并且在4 °C下進行相應初級抗體（1:100)標記過 夜。接著于PBS(pH 7. 4)中沖洗細胞，并且使用針對相應初級抗體的Alexafluor-488和 Alexafluor-555 二級抗體（1:250) (Invitrogen)進行染色。
[0129] 對于核染色，持續(xù)60分鐘連同二級抗體一起并入DRAQ5 (Cell Signaling) (1:500)。WGA(Invitrogen)在1:1000下用于使細胞表面染色5分鐘。細胞接著用PBS(pH 7. 4) (3X15分鐘）洗滌，并且封裝在Slowfade抗淬滅劑（Invitrogen)中。對于細胞內(nèi) 染色，如上所述固定細胞，用PBS (pH 7.4)洗滌，并且于PBS (pH 7.4)/0.2 % NP40 (Sigma Aldrich)中加以滲透化20分鐘。如上所述進行阻斷、初級抗體和二級抗體孵育以及封裝。 對于使3D培養(yǎng)球體染色，利用以上細胞外和細胞內(nèi)染色方法，其中將初級抗體的孵育時間 修改為36小時，并且將二級抗體的孵育時間修改為4小時。
[0130] 對于在體內(nèi)標記細胞，在RBC溶解之后獲得的總細胞混合物于PBS (pH 7. 4)中洗 滌兩次，并且使用84-1抗體在冰上標記20分鐘，接著于PBS (pH 7. 4)中洗滌染色的細胞 兩次，并且用針對84-1的二級抗體Alexaf luor-488染色20分鐘，并且在于PBS (pH 7. 4) 中洗滌兩次之后，將細胞涂鋪在培養(yǎng)皿上，并且在Jenco落射熒光倒置顯微鏡下目視觀察 Alexafluor-488陽性細胞并使用提供的軟件獲得圖片。僅高強度綠色熒光細胞被考慮供分 析。通過細胞外加測定來確認這個測定的靈敏性。對于活細胞成像，使激光強度保持在為 獲得圖像所需的最低限度以使光致漂白和光毒性最小?；蛘撸贑D45清除之后，使用相應 抗體將細胞進行84-1和⑶45 (AbCAM)染色，并且使用Cytofuge (Iris)涂鋪在玻璃載片上， 并且使用共焦顯微術(shù)分析84-1+和⑶45-細胞。
[0131] 對于共焦分析，用Zeiss LSM 510共焦顯微鏡，使用LSM 53. 2圖像捕集和分析軟 件（Zeiss)以8位獲取圖像。以數(shù)字變焦利用63X水浸物鏡（NA，1.0)進行圖像捕集。所 有圖像都由同一使用者使用相同強度和光檢測器增益獲取以允許定量比較不同樣品之間 的相對免疫反應性水平。
[0132] 外加測定。為證明由84-1抗體達成的捕集精確度和可重現(xiàn)性，向從未處理小鼠收 集的血液中外加培養(yǎng)的癌細胞。對于精確度證明，一式三份向ImL全血中外加~5、~25 和~50個K7M3、K7、LM8和DUNN。對于細胞計數(shù)，收集培養(yǎng)基中的細胞，接著連續(xù)稀釋以獲 得所需計數(shù)，其接著在顯微鏡下以一系列5 μ L斑點加以確認。在其中觀察到較低/較高數(shù) 目的細胞的情況下，進行計算以混合并獲得為被外加所需的必要細胞計數(shù)。一式三份進行 外加實驗以確保方法的靈敏性和特異性。對于陰性對照，向血液中外加 CSV陰性細胞，并且 關(guān)于陽性選擇進行分析。
[0133] 突變分析。使用REPLI-g小型試劑盒（QIAGEN，Valencia, CA)從少數(shù)CTC細胞或 單細胞進行全基因組擴增。簡要來說，通過在微型離心管中添加3 μ 1緩沖液D2來溶解于 4μ1 PBS中的細胞材料，并且在65°C下孵育10分鐘。遵循生產(chǎn)商推薦，在相同管中進行全 基因組擴增。通過