一套用于沙門氏菌檢測(cè)的多核苷酸、方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一套生物工程技術(shù)領(lǐng)域的質(zhì)粒分子，具體涉及一套用于沙門氏菌檢測(cè) 的多核苷酸、方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會(huì)的進(jìn)步和人民生活水平的提高，食品安全已經(jīng)成為一個(gè)全球關(guān)注的焦點(diǎn) 問(wèn)題，由各種食源性病原微生物引起的食物中毒事件，越來(lái)越多地引起專家和各國(guó)政府的 關(guān)注。及時(shí)有效地檢測(cè)和確定致病菌成為食源性疾病預(yù)防和治療的關(guān)鍵。沙門氏菌是一種 重要的食源性致病菌，由沙門氏菌引起的食物中毒事件在世界各國(guó)頻頻報(bào)道。2007年2月， 美國(guó)發(fā)生的"花生醬事件"，2005~2006年間，美國(guó)發(fā)生的"番茄事件"均是因沙門氏菌引 發(fā)。2006年盧森堡公國(guó)，沙門氏菌引起133人食物中毒，1人死亡。2005年6~10月之間， 澳大利亞塔斯馬尼亞州爆發(fā)了5次沙門氏菌引起的食物中毒，感染125人。2005年法國(guó)因 牛奶引起的沙門氏菌中毒事件，同時(shí)感染100多嬰兒。1990~2003年間西班牙加泰羅尼亞 地區(qū)，共爆發(fā)1078次食物中毒，其中因沙門氏菌引起為871次，14695人感染，1534人住院 治療，4人死亡，所占比例高達(dá)80.8%。在我國(guó)，細(xì)菌性食物中毒中有70%~80%是由沙門 氏菌引起的，以沙門氏菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的首位。由上可見(jiàn)，食品行業(yè)沙 門氏菌的檢測(cè)尤為重要。
[0003]現(xiàn)有沙門氏菌檢測(cè)方法主要為生化鑒定和PCR相關(guān)方法。生化鑒定方法耗時(shí)耗 力，而PCR方法和熒光定量PCR方法具有快速準(zhǔn)確、敏感性強(qiáng)的特點(diǎn)，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快，在沙門氏菌檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。
[0004]質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是一套含有檢測(cè)目的基因的特異性片段的重組質(zhì)粒分子，在 PCR定性檢測(cè)中可以作為陽(yáng)性對(duì)照，在PCR定量分析中可以作為定量分析的標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建定 量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。目前質(zhì)粒DNA分子作為基因檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)得到了越來(lái)越多的深入研 究和應(yīng)用，但是針對(duì)沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還是空白。在實(shí) 際沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR時(shí)，各單位使用的多是自行設(shè)計(jì)構(gòu)建的質(zhì)粒DNA分子作為標(biāo)準(zhǔn)品， 其中的目的基因特異性片段各不相同，同時(shí)缺乏統(tǒng)一的定值方法，質(zhì)粒DNA分子定值準(zhǔn)確 度差，造成各實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)結(jié)果差異極大，缺乏可比性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一套適用于沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn) 分子及其應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供一套適用于沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的質(zhì)粒標(biāo) 準(zhǔn)分子及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的第一方面，提供了一套分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含沙門氏菌編 碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的irwA基因序列和/或沙門氏菌編碼鞭毛抗原的sefA基 因序列。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述沙門氏菌invA基因基因序列選自下組：
[0009] (a)序列如SEQIDN0.:1所示的多核苷酸序列；
[0010] (b)核苷酸序列與SEQIDNO. : 1所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0011] (C)序列與SEQIDN0. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互補(bǔ)并且長(zhǎng)度為SEQID NO. :1所示序列長(zhǎng)度的20% -100% (較佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0012] (d)與（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述沙門氏菌的sefA基因基因序列選自下組：
[0014] (a)序列如SEQIDN0. : 3所示的多核苷酸序列；
[0015] (b)核苷酸序列與SEQIDN0. :3所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0016] (c)序列與SEQIDN0. : 3所示多核苷酸完全匹配或完全互補(bǔ)并且長(zhǎng)度為SEQID NO. : 3所示序列長(zhǎng)度的20% -100% (較佳地50 % -100%，更佳地80 % -100%，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列；
[0017] (d)與（a)-(C)任一所述的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸含有沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白 的invA基因序列和沙門氏菌編碼鞭毛抗原的sefA基因序列，以及任選地連接兩種基因序 列的接頭序列。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸序列如SEQIDNO. : 1所示。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸序列如SEQIDN0. :3所示。
[0021] 本發(fā)明的第二方面，提供了一套分離的DNA構(gòu)建物，所述DNA構(gòu)建物中包含本發(fā)明 第一方面所述的多核苷酸，以及任選的標(biāo)簽序列、酶切序列、啟動(dòng)子序列和/或載體序列。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述DNA構(gòu)建物中包含沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面 蛋白的invA基因序列和沙門氏菌編碼鞭毛抗原的sefA基因序列。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述DNA構(gòu)建物為線性DNA構(gòu)建物或環(huán)狀DNA構(gòu)建物。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述DNA構(gòu)建物為質(zhì)?；虮磉_(dá)載體。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)?；虮磉_(dá)載體作為沙門氏菌檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)分子（質(zhì)粒標(biāo) 準(zhǔn)分子）。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)?；虮磉_(dá)載體的骨架質(zhì)粒選自下組：pUC19,pUC18， pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK和pGEM。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述質(zhì)粒的序列如SEQIDNO:2或4所示。
[0028] 本發(fā)明的第三方面，提供了一套試劑盒，所述試劑盒中包括本發(fā)明第一方面所述 的多核苷酸或者本發(fā)明第二方面所述的DNA構(gòu)建物。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括引物對(duì)，所述引物對(duì)特異性擴(kuò)增沙門氏菌 編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的invA基因序列。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，特異性擴(kuò)增沙門氏菌invA基因序列的所述的引物對(duì)選自下組：
[0031]SEQIDN0. :5 和SEQIDN0. :6 所示的引物對(duì)；
[0032]SEQIDN0. :7 和SEQIDN0. :8 所示的引物對(duì)；
[0033]SEQIDNO. :9 和SEQIDNO. : 10 所示的引物對(duì)；和
[0034]SEQIDNO. : 11 和SEQIDNO. : 12 所示的引物對(duì)。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括引物對(duì)，所述引物對(duì)特異性擴(kuò)增沙門氏菌 編碼鞭毛抗原的sefA基因序列。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，特異性擴(kuò)增沙門氏菌的sefA基因序列的引物對(duì)選自下組：
[0037]SEQIDN0. : 14 和SEQIDN0. : 15 所示的引物對(duì)；
[0038]SEQIDN0. : 16 和SEQIDN0. : 17 所示的引物對(duì)；和
[0039]SEQIDN0. : 18 和SEQIDN0. : 19 所示的引物對(duì)。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括選自下組的探針序列，所述探針序列如SEQ IDN0. : 13 所示。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括選自下組的探針序列，所述探針序列如SEQ IDΝα: 20 所示。
[0042] 本發(fā)明的第四方面，提供了如本發(fā)明第一方面所述的多核苷酸、本發(fā)明第二方面 所述的DNA構(gòu)建物、或本發(fā)明第三方面所述的試劑盒的用途，其特征在于，用于沙門氏菌的 檢測(cè)。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)為非診斷或治療目的。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)為熒光定量PCR檢測(cè)。
[0045] 本發(fā)明的第五方面，提供了一套沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，所采用的 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是如本發(fā)明第一方面所述的多核苷酸或本發(fā)明第二方面所述的DNA構(gòu)建物。
[0046] 本發(fā)明的第六方面，提供了一套多核苷酸產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括：
[0047] (i)沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品，所述的標(biāo)準(zhǔn)品選自：本發(fā)明第一方面所述的多核苷酸或者 本發(fā)明第二方面所述的DNA構(gòu)建物；
[0048](ii)特異性擴(kuò)增沙門氏菌序列的引物對(duì)，所述引物對(duì)為：
[0049]SEQIDN0. :5和SEQIDN0. :6所示的序列構(gòu)成的引物對(duì)；和/或
[0050]SEQIDN0. : 14和SEQIDN0. : 15所示的序列構(gòu)成的引物對(duì)。
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述的產(chǎn)品為多核苷酸的組合（combination)，較佳地所述組分 ⑴和（ii)是各自獨(dú)立的。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述的產(chǎn)品為試劑盒形式。
[0053] 本發(fā)明的第七方面，提供了一套沙門氏菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，包括以下 步驟：
[0054] ①人工合成沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的in