沙門(mén)氏菌的特異性序列，所述序列如SEQIDN0 :1和/或3所示；
[0117] ②將步驟①所得沙門(mén)氏菌的序列克隆至克隆載體上，得到沙門(mén)氏菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分 子。
[0118] 其中步驟①所述的人工合成的方法較佳地為：全基因合成或者PCR引物擴(kuò)增的方 法獲得該序列。
[0119] 本發(fā)明所述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子構(gòu)建方法較佳地包括以下步驟：
[0120] ①NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心）的Genbank中查詢(xún)沙門(mén)氏菌的內(nèi)化素基因 InlA基因和/或轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)蛋白基因prfA基因；
[0121] ②對(duì)上述序列進(jìn)行分析，選擇合適的序列和合適的酶切位點(diǎn)，并將酶切位點(diǎn)加至 所選擇序列的5'端和3'端。
[0122] ③將處理后的序列進(jìn)行全基因人工合成服務(wù)，包括單鏈OligoDNA的合成、DNA片 段拼接等工作，并將全長(zhǎng)基因克隆至質(zhì)粒載體中，獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子。
[0123] 所述的質(zhì)粒載體可以是常規(guī)載體，較佳的是克隆載體，更佳的是能夠在大腸桿菌 中增殖的克隆載體，所述克隆載體較佳地為：PUC19,pUC18,pUC118,pUC119,pBlueScript IISK或pGEM系列載體，優(yōu)選地為pUC19克隆載體。
[0124] ④測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的序列。
[0125] ⑤質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證。
[0126] 所述的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法驗(yàn)證，是指檢測(cè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 分析時(shí)的特異性和構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)能力等特性，以鑒定該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子作為實(shí)時(shí)熒光PCR方 法檢測(cè)沙門(mén)氏菌的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的能力。
[0127] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0128] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0129] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0130] (1)包含本發(fā)明多核苷酸序列的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子具有均勻性強(qiáng)，穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)，同 時(shí)本發(fā)明解決了沙門(mén)氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題，保證沙門(mén)氏菌實(shí)時(shí)熒 光PCR方法檢測(cè)結(jié)果的可比性，為沙門(mén)氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)提供質(zhì)量控制；
[0131] (2)使用本發(fā)明的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子配合本發(fā)明的引物對(duì)制備的產(chǎn)品，用于實(shí)時(shí)熒光 PCR檢測(cè)沙門(mén)氏菌時(shí)，特異性強(qiáng)，靈敏度高，線(xiàn)性穩(wěn)定。
[0132] (3)本發(fā)明提供的試劑盒中包含了檢測(cè)沙門(mén)氏菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子（攜帶invA基因 的pXLlO質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子）和/或檢測(cè)沙門(mén)氏菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子（攜帶sefA基因的pXLll 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子），
[0133] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步陳述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。
[0134] 實(shí)施例1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建
[0135] 實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)儀器：
[0136]質(zhì)粒大量提取試劑盒（OMEGA)，其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純生化試 劑；實(shí)驗(yàn)儀器包括離心機(jī)、恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)搖床、移液槍等。
[0137] 實(shí)驗(yàn)方法包括以下步驟：
[0138] 1、在GenBank中搜索沙門(mén)氏菌的invA基因序列；
[0139] 2、對(duì)上述序列進(jìn)行分析，選擇合適的序列和合適的酶切位點(diǎn)，沙門(mén)氏菌的invA基 因序列長(zhǎng)度為2058bp，兩端加上ΚρηΙ酶切位點(diǎn)；
[0140] 3、將處理后的序列送至寶生物工程（大連）有限公司，由其負(fù)責(zé)進(jìn)行全基因人工 合成服務(wù)，包括單鏈OligoDNA的合成、DNA片段拼接等工作，所得基因invA基因的序列如 序列表中SEQIDNO: 1所示，將所得全長(zhǎng)基因克隆至質(zhì)粒載體pUC19(購(gòu)自TAKARA公司） 中，構(gòu)建獲得包含invA基因序列的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXLlO(其序列如序列表中SEQIDN0:2 所示），構(gòu)建所得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL10的質(zhì)粒圖譜如圖1所示。
[0141] 4、大量培養(yǎng)含有包含所得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXLlO的重組大腸桿菌，利用質(zhì)粒大量提 取試劑盒（OMEGA)提取質(zhì)粒，獲得高純度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXLlO。經(jīng)過(guò)紫外分光光度計(jì)以 及電泳進(jìn)行純度分析，之后質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)分子置于-20°C保存，抽提質(zhì)粒的方法包括以下步 驟：
[0142] a、將100~200mL過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌于室溫5000Xg離心10分鐘，棄去上清；
[0143] b、加入 12mLSolutionI(含有RNaseA)，振蕩充分混勻；
[0144] c、加入12mLSolutionII，上下顛倒溫和混勻，室溫放置2分鐘以使菌體充分裂 解；
[0145] d、加入16mLSolutionIII，立即上下充分顛倒混勻數(shù)次，直至形成均勻的白色沉 淀；
[0146] e、彡 12000Xg，4°C離心 10 分鐘；
[0147] f、吸取20mL上清小心地移至一個(gè)干凈的HiBindMaxi吸附柱中（置于50mL收集 管中），5000Xg室溫離心5分鐘；
[0148] g、棄去收集管中的液體，加入10mLBufferHB清洗吸附柱，5000Xg室溫離心5分 鐘；
[0149] h、棄去收集管中的液體，加入15mLDNAWashBuffer(無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)┣逑次?柱；
[0150] i、重復(fù)上述清洗步驟；
[0151] j、6000Xg離心15分鐘以干燥吸附柱；
[0152] k、將吸附柱置于一個(gè)干凈的50mL管中，加入2mL~3mLTE緩沖液，室溫放置1~ 2分鐘，8000Xg離心2分鐘以洗脫DNA，所得DNA溶液即為提取的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子溶液，保存 在-20。。。
[0153] 5、測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXLlO
[0154] 將提取的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子送至八家測(cè)序公司進(jìn)行序列驗(yàn)證，八家測(cè)序公司分別為北 京六合華大基因科技股份有限公司、上海博尚生物技術(shù)有限公司、英濰捷基（上海）貿(mào)易有 限公司、上海杰李生物技術(shù)有限公司、上海美吉生物技術(shù)有限公司、上海生工生物技術(shù)有限 公司、蘇州金唯智生物科技有限公司、寶生物生物工程有限公司。對(duì)于質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái) 說(shuō)，序列長(zhǎng)度與定量有直接關(guān)系，8家不同的測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中對(duì)于 定值的要求。詳見(jiàn)ISO導(dǎo)則35,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值部分的具體要求。
[0155]序列考察公式：序列正確率=正確堿基數(shù)目/堿基總數(shù)
[0156] 測(cè)序結(jié)果證明，所有參與序列驗(yàn)證的單位得到的序列正確率為100 %，該質(zhì)粒序列 中的第414位到第2471位為invA基因序列
[0157] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：經(jīng)過(guò)序列選擇步驟、全基因人工合成步驟以及質(zhì)粒大量提取等步驟 得到高純度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子PXL10經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子插入片段序列與設(shè)計(jì)完全 相符。
[0158] 采用上述相同的方法，構(gòu)建pXLll質(zhì)粒，將所得sefA基因序列（如序列表中SEQ IDN0:3所示），克隆至質(zhì)粒載體pUC19中，構(gòu)建獲得包含sefA基因序列的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子 pXLll(其序列如序列表中SEQIDN0:4所示），構(gòu)建所得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXLll的質(zhì)粒圖譜 如圖4所示。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子插入片段序列與設(shè)計(jì)完全相符。
[0159] 實(shí)施例2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXLlO和pXLl1的均勻性檢驗(yàn)
[0160] 均勻性是表征物質(zhì)中一套或多種特性相關(guān)的結(jié)構(gòu)或組成的一致性狀態(tài)。通過(guò)測(cè)量 取自不同包裝單元（如瓶、包等）或取自同一包裝單元不同位置的規(guī)定大小的樣品，測(cè)量結(jié) 果落在規(guī)定不確定度范圍內(nèi)，則可認(rèn)為該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)指定的特性量是均勻的。均勻性是標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)的基本屬性，用于描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性的空間分布特征。在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制（生產(chǎn)） 過(guò)程中必須進(jìn)行均勻性評(píng)估，以證明其具有良好的均勻性。均勻性良好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子，其 量值不會(huì)受到分裝等因素的影響，各瓶間的量值差異不大，因此保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
[0161] 實(shí)驗(yàn)試劑TE緩沖液（pH7. 5)。實(shí)驗(yàn)儀器NanodropsND-2000。
[0162] 實(shí)驗(yàn)方法：
[0163] 1、按照《JJG1006-1994 -級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》均勻性抽取樣品要求，從各質(zhì)粒 DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取15瓶。
[0164] 2、對(duì)所取每個(gè)樣品取樣3次，每次取樣量為1μL。每個(gè)取樣量用紫外分光光度重 復(fù)測(cè)定3次，取平均值。
[0165] 3、對(duì)測(cè)定結(jié)果用F檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，判斷均勻性檢驗(yàn)結(jié)果。具體方法為：抽取m個(gè) 樣本，在相同條件下測(cè)得m組等精度測(cè)量數(shù)據(jù)，如果測(cè)定方差無(wú)顯著性差異，則應(yīng)滿(mǎn)足下式 的統(tǒng)計(jì)要求。
[0167] 其中組間差方和計(jì)算公式為：
[0169] 組內(nèi)差方和計(jì)算見(jiàn)公式為：
[0171] v1=m-Ι(組間自由度）
[0172]v2=N-m(組內(nèi)自由度）。
[0173] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0174] 1、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXLlO和pX