獲得的能夠成功擴(kuò)增目標(biāo)序列的引物和探針序詳見表13。
[0262] 表13實(shí)驗(yàn)中采用的引物和探針序列
[0263]
[0264] 針對沙門氏菌的invA基因序列，引物對1的檢測效果最好，特異性強(qiáng)，擴(kuò)增后沒有 非特異性的條帶出現(xiàn)，檢測靈敏度最高，最低可檢測7. 30copies/yL的目標(biāo)序列；引物對 2和3的靈敏度較低，能夠檢測到7. 30X 102copies/ μ L的目標(biāo)序列；引物對4能夠檢測到 7. 30 X lOkopies/μ L的目標(biāo)序列，但是特異性較差，有非特異性條帶出現(xiàn)。
[0265] 針對沙門氏菌的sefA基因序列，引物對5的檢測效果最好，特異性強(qiáng)，擴(kuò)增后沒 有非特異性的條帶出現(xiàn)，檢測靈敏度最高，最低可檢測7. 15copies/yL的目標(biāo)序列；引物 對6的靈敏度較低，能夠檢測到7. 15X 102copies/ μ L的目標(biāo)序列；引物對7能夠檢測到 7. 15 X lOkopies/μ L的目標(biāo)序列，但是特異性較差，有非特異性條帶出現(xiàn)。
[0266] 2、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXLlO在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測中的應(yīng)用
[0267] 使用引物對1，分別以不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL 10(如：7. 30 X 106copies/ yL、7.30X 105copies / yL、7.30X 104copies / yL、7.30X 103copies / yL、 7. 30X 102copies/yL、7. SOXlOkopies/yL、？· 30X10°copies/yL)作為標(biāo)準(zhǔn)品建立實(shí)時(shí) 熒光PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3,相關(guān)系數(shù)達(dá)到0. 999,線性良好，表明質(zhì)粒標(biāo) 準(zhǔn)分子PXL10適合應(yīng)用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，可作為實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增沙門氏菌的陽性標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)。
[0268] 使用引物對5，分別以不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pXL 11(如：7. 15 X 106copies/ yL、7. 15X105copies / yL、7. 15X104copies / yL、7. 15X103copies / yL、 7. 15X102copies/yL、7. UXlOkopies/yL、？· 15X10°copies/yL)作為標(biāo)準(zhǔn)品建立實(shí)時(shí) 熒光PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6,相關(guān)系數(shù)達(dá)到0. 999,線性良好，表明質(zhì)粒標(biāo) 準(zhǔn)分子pXLll適合應(yīng)用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，可作為實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增沙門氏菌的陽性標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)。
[0269] 在實(shí)際沙門氏菌檢測時(shí)，可利用該線性良好引物對制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過實(shí)驗(yàn)熒 光PCR方法檢測出待測樣品中沙門氏菌特定基因的拷貝數(shù)，并可根據(jù)沙門氏菌特定基因的 拷貝數(shù)與細(xì)菌總數(shù)之間的線性關(guān)系，換算出沙門氏菌的具體個(gè)數(shù)。由于目前針對沙門氏菌 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)仍是空白，在實(shí)際沙門氏菌實(shí)時(shí)PCR檢測時(shí)，各單 位使用的多是自行設(shè)計(jì)構(gòu)建的質(zhì)粒DNA分子作為標(biāo)準(zhǔn)品，其中的目的基因特異性片段各不 相同，同時(shí)缺乏統(tǒng)一的定值方法，質(zhì)粒DNA分子定值準(zhǔn)確度差，造成各實(shí)驗(yàn)室之間的檢測結(jié) 果差異極大，缺乏可比性、有效性和可靠性。因此，本質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子可以解決實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測沙門氏菌時(shí)缺乏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的難題，適用于多種擴(kuò)增沙門氏菌的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，保 證檢測結(jié)果的可比性，為沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測提供生物計(jì)量技術(shù)支持。
[0270] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測沙門氏菌的試劑盒，其特在于，所述試劑盒中包括： 標(biāo)準(zhǔn)分子，所述標(biāo)準(zhǔn)分子中含有SEQIDNO. : 1所示的多核苷酸和/或SEQIDNO. : 3 所示的多核苷酸； 優(yōu)選地，所述試劑盒中還包括，用于特異性擴(kuò)增SEQIDNO. :1所示的序列的引物序列 和/或用于特異性擴(kuò)增SEQIDNO. :3所示的序列的引物序列； 其中，所述用于特異性擴(kuò)增SEQIDNO. :1所示的序列的引物序列選自下組： (1)SEQIDNO. :5和SEQIDNO. :6所示的引物序列； (2)SEQIDNO. :7和SEQIDNO. :8所示的引物序列； (3)SEQIDNO. :9和SEQIDNO. :10所示的引物序列；和 (4)SEQIDNO. :11 和SEQIDNO. :12 所示的引物序列； 所示用于特異性擴(kuò)增SEQIDNO. :3所示的序列的引物序列選自下組： SEQIDNO. : 14 和SEQIDNO. : 15 所示的引物對； SEQIDNO. : 16和SEQIDNO. : 17所示的引物對；和SEQIDNO. : 18 和SEQIDNO. : 19 所示的引物對。2. -種分離的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列選自下組： (a) 序列如SEQIDNO. : 1或3所示的多核苷酸序列； (b) 核苷酸序列與SEQIDNO. : 1或3所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 多核苷酸序列； (c) 序列與SEQIDNO. : 1或3所示多核苷酸完全匹配或完全互補(bǔ)并且長度為SEQID NO. : 1或3所示序列長度的20 %-100 % (較佳地50 %-100 %，更佳地80 %-100 %，最佳地 90% -100%，如95% )的多核苷酸序列； (d) 與（a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。3. -種分離的DNA構(gòu)建物，其特征在于，所述DNA構(gòu)建物中包含權(quán)利要求2所述的多核 苷酸，以及任選的標(biāo)簽序列、酶切序列、啟動子序列和/或載體序列。4. 如權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建物，其特征在于，所述DNA構(gòu)建物為線性DNA構(gòu)建物或 環(huán)狀DNA構(gòu)建物；優(yōu)選地所述DNA構(gòu)建物為質(zhì)?；虮磉_(dá)載體；更優(yōu)選地，所述質(zhì)?；虮磉_(dá)載 體的序列如SEQIDNO:2或3所示。5. -種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括權(quán)利要求2所述多核苷酸或者權(quán)利要 求3所述的DNA構(gòu)建物。6. 如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括特異性擴(kuò)增沙門氏 菌的invA基因序列的引物對，和/或特異性擴(kuò)增沙門氏菌的sefA基因的引物對；優(yōu)選地特 異性擴(kuò)增沙門氏菌的irwA基因序列的引物對選自下組： SEQIDNO. :5和SEQIDNO. :6所示的引物對； SEQIDNO. :7和SEQIDNO. :8所示的引物對； SEQIDNO. :9和SEQIDNO. : 10所示的引物對；和SEQIDNO. : 11 和SEQIDNO. : 12 所示的引物對； 特異性擴(kuò)增沙門氏菌的sefA基因序列的引物對選自下組： SEQIDNO. : 14 和SEQIDNO. : 15 所示的引物對； SEQIDNO. : 16和SEQIDNO. : 17所示的引物對；和 SEQIDNO. : 18 和SEQIDNO. : 19 所示的引物對。7. 如權(quán)利要求2所述的多核苷酸、權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建物、或權(quán)利要求5所述的 試劑盒的用途，其特征在于，用于沙門氏菌的檢測。8. -種沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所采用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是如權(quán) 利要求2所述的多核苷酸或權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建物。9. 一種多核苷酸產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括： (i)沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品，所述的標(biāo)準(zhǔn)品選自：權(quán)利要求2所述多核苷酸或者權(quán)利要求3所 述DNA構(gòu)建物；和 (ii)特異性擴(kuò)增沙門氏菌基因序列的引物對，所述引物對為： SEQIDNO. :5和SEQIDNO. :6所示的序列構(gòu)成的引物對；和/或SEQIDNO. : 14和SEQIDNO. : 15所示的序列構(gòu)成的引物對。10. -種沙門氏菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： ① 人工合成沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細(xì)胞表面蛋白的invA基因序列和/或沙門 氏菌碼鞭毛抗原的sefA基因序列，所述沙門氏菌invA基因序列和所述沙門氏菌的sefA基 因序列分別如SEQIDNO. : 1和SEQIDNO:3所示； ② 將步驟①所得基因序列克隆至克隆載體上，得到沙門氏菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子； 優(yōu)選地，步驟@所述克隆載體為口1](：19，？1](：18，？1](：118，？1](：119，？811163(^丨？七1131(或 pGEM〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于沙門氏菌檢測的多核苷酸、方法和試劑盒。具體地本發(fā)明中公開了可用作沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)分子的多核苷酸和DNA構(gòu)建物pXL10和pXL11。本發(fā)明的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子解決了沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR檢測中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的難題，保證沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測結(jié)果的可比性，為沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測提供了可靠質(zhì)量控制方法。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/04, C12N15/63, C12N15/31
【公開號】CN105296664
【申請?zhí)枴緾N201510875470
【發(fā)明人】許麗, 劉剛, 梁文, 李妍, 聞艷麗, 李蘭英, 徐勤
【申請人】上海市計(jì)量測試技術(shù)研究院
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年12月2日