快速簡易分離純化降纖酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001 ] ：本發(fā)明涉及快速簡易分離純化降纖酶的方法。
【背景技術(shù)】 [0002] ：降纖酶是特定蛇毒當(dāng)中提取的一種蛋白酶，它有溶栓、抗栓、降黏、降 纖等明確的藥理作用，廣泛應(yīng)用于各種栓塞性疾病比如腦血栓、短暫性腦缺血發(fā)作、心肌梗 死、股動(dòng)脈栓塞、血栓閉塞性脈管炎、肺栓塞等。
[0003] 我院是治療血栓病的?？漆t(yī)院，是血栓病國家重點(diǎn)?？漆t(yī)院。從上世紀(jì)八十年代 開始使用蛇毒制劑，是最早使用蛇毒制劑治療血栓病的醫(yī)院，可以說我院是從蛇毒制劑開 始起家的。蛇毒抗栓制劑從第一代產(chǎn)品蝮蛇抗栓酶到第二代產(chǎn)品精制蝮蛇抗栓酶再到第三 代產(chǎn)品降纖酶，經(jīng)歷了從多組分制劑到單組分制劑，從副作用比較大到幾乎沒有副作用，這 樣一個(gè)內(nèi)在質(zhì)量逐步提升的過程。我們醫(yī)院研究所一直從事于蛇毒成分的分離純化及臨床 應(yīng)用研究，積累了比較豐富的經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)技能，這為以后繼續(xù)從事更高層面的蛇毒有效成 分的分離純化、臨床應(yīng)用研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[0004] 從包含數(shù)百種化合物的蛇毒當(dāng)中分離純化有效成分一降纖酶確實(shí)是一件不容易 的工作。由于蛇毒當(dāng)中的成分太復(fù)雜，分離降纖酶的工藝大多操作復(fù)雜、步驟多、分離柱子 多，所以所需時(shí)間往往很長，而又由于步驟多時(shí)間長當(dāng)然損失多、收率也不高、染菌污染的 機(jī)會(huì)就多。下面具體介紹一下這些分離純化降纖酶的方法：
[0005] 管利豐等〔1〕報(bào)道的方法為：將蛇毒粗品200毫克溶于含lX10_2mol/L EDTA，pH8. 0的0. 005mol/L磷酸鹽緩沖液20ml中，使蛇毒中金屬蛋白水解酶失活。在對(duì) 含lX10-4mol/LEDTA透析后，將溶液通過EDTA-纖維素（DE-52 )層析，得到3個(gè)具精 氨酸酯酶活性的峰，即緩激肽釋放，凝結(jié)活性和溶血纖原的活性3類成分。其中凝結(jié)活性 的成分即類凝血酶，約占總精氨酸酯酶活性的60 %。將上述具凝結(jié)活性成分的凍干品3克 溶于含〇·lmol/LEDTA，ρΗ7· 2的0· 005mol/L磷酸鹽緩沖液10ml中，離心。上清液通過 S印hadexG-25柱并用同種緩沖液洗脫，其第一個(gè)峰即類凝血酶，再進(jìn)一步純化。
[0006] 將洗脫液再用DE-22柱層析，條件同DE-52柱，收集類凝血酶活性部分，透析并凍 干。凍干物100毫克溶于PH8. 0的0. 005mol/L磷酸鹽緩沖液10毫升中，用DE-52柱層析。 將具類凝血酶活性部分再用DE-52柱層析一次。所得活性成分20毫克再通過S印hadexG-75 柱純化得精品。
[0007] 管利豐等〔2〕又將上述制備方法進(jìn)行改進(jìn)，如下所述。
[0008] 蛇毒粗品用DEAE-S印hadexA-25柱層析，用ρΗ7· 8的0· 01mol/L磷酸鹽緩沖液并 0~0·lmol/L氯化鈉線性梯度洗脫類凝血酶。收集活性成分對(duì)ρΗ5· 0的0· 01mol/L醋酸鈉 緩沖液透析，然后通過SP-SephadexC-25柱層析，在同種緩沖液中以0~0. 15mol/L氯化鈉 線性梯度洗脫。收集活性成分再通過SephadexG-75柱層析，純化物凍干得精品。
[0009] 孔維權(quán)等〔3〕報(bào)道的方法為（1 )取蛇毒粗品16克，用EDTA絡(luò)合-硫氰酸鉀沉 淀法初步分離類凝血酶，在上層析柱前先將出血毒去除，并去除一部分非類凝血酶成分；（ 2 )用DEAE-SepharoseFastFlow快速柱層析，ρΗ8· 0 的 0· 05mol/LTris-HCL平衡，由（ 1 )得到的蛇毒溶液透析脫鹽，上述緩沖液平衡，上柱并進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件混合筒為PH8. 0的0. 05mol/LTris-HCL2000ml作起始緩沖液，貯存筒為含0. 4mol/L氯化鈉的上述起 始緩沖液。測定洗脫液在波長280nm處的吸光度A，以A為縱坐標(biāo)，管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制層析 圖，測定各峰類凝血酶活性及分子量分布，取與降纖酶性質(zhì)相同的洗脫組分進(jìn)行下一步純 化；（3 )用Sephadex_75prepgrad柱層析，無熱原蒸餾水平衡，取上述（2 )所得組分， 濃縮后上柱，無熱原蒸餾水洗脫，測定洗脫液280處A，繪制層析圖。逐管檢測凝血活性，將 具有凝血活性的組分每3管合并，取樣作SDS-PAGE，合并收集單一區(qū)帶（相對(duì)分子質(zhì)量Mr 為36000 )組分，即為純化的降纖酶。
[0010] 楊開榮等〔4〕報(bào)道的方法為：（1)取DEAE-S印hadex A-50,加入新鮮蒸餾水， 加熱煮沸15min，放至室溫，加PH7. 6的0. 05mol/L Tris-HCL緩沖液攪拌，放置數(shù)小時(shí)，棄 去上清液，再加入上述緩沖液，如此反復(fù)數(shù)次，測pH為7. 6,即達(dá)平衡。用上述緩沖液平衡， 是因?yàn)榻道w酶的最適pH為7.4~7. 6,且在ρΗ7· 6的條件下，DEAE-Sephadex A-50穩(wěn)定。 (2)蛇毒粗品均勻加在DEAE-Sephadex A-50柱中。洗脫條件，第一梯度，在攪拌瓶中加 ρΗ7· 6, 0·lmol/L氯化鈉的Tris緩沖液1000ml;第二梯度，在攪拌瓶中加ρΗ7· 6, 0·lmol/L氯化鈉的Tris緩沖液1000ml，貯存瓶中加pH7. 6, 0.lmol/L氯化鈉的Tris緩沖液1000ml。 共分離出9個(gè)峰，將合格峰合并，即得。
[0011] 何國振等〔5〕：用柱層析結(jié)合親和層析法生產(chǎn)降纖酶，有所改進(jìn)，具體操作如下： 將尖吻蝮蛇蛇毒20克溶于8. 0的緩沖液1000ml中，上柱，用平衡緩沖液沖洗后再用含0. 15 氯化鈉的緩沖液洗脫，收集含降纖酶活性成分的溶液。親和層析填料系用經(jīng)溴化氰活化，接 上二氨基二丙基胺后經(jīng)琥珀酸化，偶聯(lián)親和降纖酶的配基而成。將柱層析收集的洗脫液上 親和層析柱，用平衡緩沖液沖洗后，用含0. 2鹽酸胍的平衡緩沖液洗脫，收集洗脫液，經(jīng)超 濾去鹽濃縮，凍干，即得產(chǎn)品。此法從蛇毒20克制得產(chǎn)品69. 3毫克，比活2886單位/毫克。
[0012] 王劍〔6〕應(yīng)用親和層析和凝膠過濾從白眉蝮蛇蛇毒中分離降纖酶。蛇毒干品2克 溶于甘氨酸緩沖液中，離心，取上清液，上經(jīng)處理的溴化氰活化Sepharose4B柱，用不同濃 度氯化鈉的甘氨酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集活性成分，置透析袋中，透析過濾。然后上經(jīng) 處理的HeparinSepharoseCL-6B柱，用含60mmol/L氯化鈉的甘氨酸洗脫，收集活性峰。將 收集液上S印hadexG-75柱，用Tris-HCL緩沖液洗脫，收集活性成分，可制得比活約1600 單位/毫克的降纖酶。
[0013]魏金榮〔7〕等方法如下：將BenzamidineSepharose6B150ml裝入A柱（ 2.6cmX30cm)中，將S印hadexG-25 200ml裝入B柱（1.6cmX100cm)中，分別用含 0.Imol/LNaCL的0. 05mol/LTris-HCL緩沖液（Ph8. 0 )平衡。取蛇毒凍干粉10克，用上 述緩沖液60ml溶解，10, 000r/min離心5min，取上清液上A柱。待供試品全部進(jìn)入膠內(nèi)，用 含 1. 50mol/LNaCL的 0· 05mol/LTris-HCL緩沖液（ρΗ8· 0 )洗脫，流速為 0· 3ml/min，棄 流出液。待紫外吸收峰回到基線后，將A柱與B柱串聯(lián)，用含0·lmol/LNaCL和0.25mol/L Benzamidine的0· 05mol/LTris-HCL緩沖液洗脫，流速0· 3ml/min，收集第II峰的后部分。
[0014] 黃寓〔8〕等報(bào)道的方法為：稱取凍干粗毒2克，溶于20ml基礎(chǔ)緩沖液（0. 02mol/ LTris-HCL，pH8. 0 )中，4°C條件下完全溶解，然后置4°C冷凍離心機(jī)，在10,000/min轉(zhuǎn)速 下離心處理10分鐘，取上清液，上預(yù)先用基礎(chǔ)緩沖液平衡好的DEAE-SepharoseFastFlow 柱。先用基礎(chǔ)緩沖液洗脫，洗脫至基線平直，然后用基礎(chǔ)緩沖液對(duì)含lmol/LNaCL的基礎(chǔ) 緩沖液進(jìn)行直線梯度洗脫（5個(gè)柱體積）。收集有降纖酶活力的部分，裝入透析袋內(nèi)，用 0· 05mol/L的磷酸鹽緩沖液（PBS,PH7. 40 )進(jìn)行透析除鹽，然后上以0· 05mol/LPBS緩沖液 (PH7.4 )平衡過的親和層析柱，上完樣先用0.05mol/LpH7.4PBS緩沖液洗脫雜蛋白，直 至基線平直。然后用0.lmol/L的甘氨酸-HCL緩沖液（Ph4.0 )洗脫，收集活性峰，立即用 lmol/L的Tris溶液中和，使pH值在6. 0~8. 0之間。
[0015] 金星光〔9〕等的純化方法如下：第一步上DEAE-SepharoseFastFlo