1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2緩 沖液充分洗脫，直至基線平直，然后用〇. 1MTris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液對(duì)含1MNaCL的 0. 1MTris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為柱體積的5倍，收集活性峰， 進(jìn)行純度鑒定、脫鹽、濃縮、凍干即可。
[0052]肝素-Sepharose4B柱的制備：
[0053]a、取 105gCNBr-activatedSepharose4B膠用ImMHCL(PH3. 0 )溶液充分膨 脹，然后用ImMHCL(PH3.0 )溶液進(jìn)行充分洗滌，lg膠要用大于200ml以上的該溶液進(jìn) 行洗滌；
[0054]b、精密稱(chēng)取420萬(wàn)單位肝素，用偶聯(lián)緩沖液即含0. 5MNaCL的0. 1M NaHC03PH8. 3±0. 2的緩沖液進(jìn)行溶解，1克肝素大約用5毫升偶聯(lián)緩沖液；
[0055] c、將含肝素的偶聯(lián)緩沖液倒入用IMm HCL(PH23. 0)溶液處理過(guò)的 CNBr-activated Sepharose4B膠里，在室溫條件下，將此混合物輕輕上下翻轉(zhuǎn)一個(gè)小時(shí)；
[0056] d、用偶聯(lián)緩沖液充分沖洗剛偶聯(lián)肝素的膠，至少?zèng)_洗膠體積的5倍以上；
[0057] e、將剛用偶聯(lián)緩沖液充分沖洗過(guò)的膠轉(zhuǎn)移到0. 1M Tris-HCL, PH8. 0±0. 2的緩沖 液中，室溫放置2小時(shí)；
[0058]f、將e項(xiàng)剛處理完的膠用含0. 5MNaCL的0. 1M醋酸/醋酸鈉PH4. 0±0. 2的緩沖 液和含0. 5MNaCL的0. 1MTris-HCL，PH8. 0±0. 2的緩沖液進(jìn)行交替洗滌，交替洗滌次數(shù)至 少3次以上，每次洗滌緩沖液的量至少是膠體積的5倍以上；將處理好的膠裝在特殊層析柱 里即可使用。
[0059]實(shí)施例3:
[0060] 該方法的步驟如下：
[0061] (1)、精密稱(chēng)取白眉複蛇毒16g，在3 °C條件下，用200ml0. 1M Tris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液進(jìn)行溶解，溶解液在3°C條件下用12500轉(zhuǎn)/分離心機(jī)離心20 分鐘，棄掉沉淀物，上清液備用；
[0062] (2)將離心上清液首先用截留分子量50, 000麗的超濾膜進(jìn)行超濾，將濾液收集 起來(lái)，然后把此濾液用截留分子量10, 000MW的超濾膜再進(jìn)行超濾，這次收集膜上部分，用 0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2 緩沖液定容至 50ml;
[0063] (3)將二次超濾后得到的50ml超濾液緩緩上已經(jīng)用0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2 緩沖液充分沖洗平衡的肝素-S印harose4B柱，上完樣，用0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2緩 沖液充分洗脫，直至基線平直，然后用〇. 1MTris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液對(duì)含1MNaCL的 0. 1MTris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為柱體積的5倍，收集活性峰， 進(jìn)行純度鑒定、脫鹽、濃縮、凍干即可。
[0064]肝素-Sepharose4B柱的制備：
[0065]a、取 110gCNBr-activatedSepharose4B膠用ImMHCL(PH2. 5 )溶液充分膨 脹，然后用ImMHCL(PH2. 5 )溶液進(jìn)行充分洗滌，lg膠要用大于200ml以上的該溶液進(jìn) 行洗滌；
[0066]b、精密稱(chēng)取440萬(wàn)單位肝素，用偶聯(lián)緩沖液即含0. 5MNaCL的0. 1M NaHC03PH8. 3±0. 2的緩沖液進(jìn)行溶解，1克肝素大約用5毫升偶聯(lián)緩沖液；
[0067] c、將含肝素的偶聯(lián)緩沖液倒入用IMm HCL ( PH2. 5)溶液處理過(guò)的 CNBr-activated Sepharose4B膠里，在室溫條件下，將此混合物輕輕上下翻轉(zhuǎn)一個(gè)小時(shí)；
[0068] d、用偶聯(lián)緩沖液充分沖洗剛偶聯(lián)肝素的膠，至少?zèng)_洗膠體積的5倍以上；
[0069] e、將剛用偶聯(lián)緩沖液充分沖洗過(guò)的膠轉(zhuǎn)移到0. 1M Tris-HCL, PH8. 0±0. 2的緩沖 液中，室溫放置2小時(shí)；
[0070]f、將e項(xiàng)剛處理完的膠用含0. 5MNaCL的0. 1M醋酸/醋酸鈉PH4. 0±0. 2的緩沖 液和含0. 5MNaCL的0. 1MTris-HCL，PH8. 0±0. 2的緩沖液進(jìn)行交替洗滌，交替洗滌次數(shù)至 少3次以上，每次洗滌緩沖液的量至少是膠體積的5倍以上；將處理好的膠裝在特殊層析柱 里即可使用。
[0071] 以下為檢驗(yàn)結(jié)果：
[0072]
[0073]
[0074] 遼寧省血栓病中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)療中心藥品檢驗(yàn)報(bào)告表
[0075]
[0076]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速簡(jiǎn)易分離純化降纖酶的方法，其特征在于：該方法上柱之前，用10,OOOMff 膜和50, 000MW膜超濾蛇毒溶液，去除絕大部分雜質(zhì)，再利用肝素-Sepharose4B柱的分離純 化進(jìn)行制備。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速簡(jiǎn)易分離純化降纖酶的方法，其特征在于：該方法的步 驟如下： (1) 、精密稱(chēng)取白眉蝮蛇毒14-16g，在3 °C~5 °C條件下，用200ml0. 1M Tris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液進(jìn)行溶解，溶解液在3°C~5°C條件下用12000~13000轉(zhuǎn)/ 分離心機(jī)離心20分鐘，棄掉沉淀物，上清液備用； (2) 將離心上清液首先用截留分子量50, 000MW的超濾膜進(jìn)行超濾，將濾液收集起來(lái)， 然后把此濾液用截留分子量10, 000MW的超濾膜再進(jìn)行超濾，這次收集膜上部分，用0. 1M Tris-HCL,ΡΗ7· 0±0· 2 緩沖液定容至 50ml; (3) 將二次超濾后得到的50ml超濾液緩緩上已經(jīng)用0. 1MTris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖 液充分沖洗平衡的肝素-Sepharose4B柱，上完樣，用0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2緩沖液充 分洗脫，直至基線平直，然后用0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2緩沖液對(duì)含1MNaCL的0. 1M Tris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積為柱體積的5倍，收集活性峰，進(jìn)行 純度鑒定、脫鹽、濃縮、凍干即可。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速簡(jiǎn)易分離純化降纖酶的方法，其特征在于： 肝素-Sepharose4B柱的制備： a、 取 100 - 110gCNBr-activatedS印harose4B膠用ImMHCL(PH2.0 ~3.0 )溶 液充分膨脹，然后用ImMHCL(PH2. 0~3. 0 )溶液進(jìn)行充分洗滌，lg膠要用大于200ml 以上的該溶液進(jìn)行洗滌； b、 精密稱(chēng)取400- 440萬(wàn)單位肝素，用偶聯(lián)緩沖液即含0. 5MNaCL的0. 1MNaHC03 PH8. 3±0. 2的緩沖液進(jìn)行溶解，1克肝素大約用5毫升偶聯(lián)緩沖液； c、將含肝素的偶聯(lián)緩沖液倒入用IMmHCL(PH2. 0~3. 0)溶液處理過(guò)的 CNBr-activatedSepharose4B膠里，在室溫條件下，將此混合物輕輕上下翻轉(zhuǎn)一個(gè)小時(shí)； d、 用偶聯(lián)緩沖液充分沖洗剛偶聯(lián)肝素的膠，至少?zèng)_洗膠體積的5倍以上； e、 將剛用偶聯(lián)緩沖液充分沖洗過(guò)的膠轉(zhuǎn)移到0. 1MTris-HCL,PH8. 0±0. 2的緩沖液中， 室溫放置2小時(shí)； f、 將e項(xiàng)剛處理完的膠用含0. 5MNaCL的0. 1M醋酸/醋酸鈉PH4. 0±0. 2的緩沖液 和含0. 5MNaCL的0. 1MTris-HCL，PH8. 0±0. 2的緩沖液進(jìn)行交替洗滌，交替洗滌次數(shù)至少 3次以上，每次洗滌緩沖液的量至少是膠體積的5倍以上；將處理好的膠裝在特殊層析柱里 即可使用。
【專(zhuān)利摘要】一種快速簡(jiǎn)易分離純化降纖酶的方法，其特征在于：該方法上柱之前，用10,000MW膜和50,000MW膜超濾蛇毒溶液，去除絕大部分雜質(zhì)，再利用肝素-Sepharose4B柱的分離純化進(jìn)行制備。本方法操作簡(jiǎn)單、步驟少、純度高、回收率高、節(jié)省時(shí)間。
【IPC分類(lèi)】C12N9/64
【公開(kāi)號(hào)】CN105349514
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510936687
【發(fā)明人】池明宇, 鄭貴元, 金星光, 關(guān)書(shū)博, 董志輝, 張家策
【申請(qǐng)人】遼寧省血栓病中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)療中心
【公開(kāi)日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年12月14日