w離子交換 柱，第二步上肝素-Sepharose4B親和層析柱，第三步上SephadexG-75凝膠層析柱。
[0016] 從以上文獻中可以看出，分離純化降纖酶使用柱子多、操作過程復雜、理所當然所 需時間也多，沒有一種方法使用了現代分離純化領域高效、先進的超濾技術。

【發(fā)明內容】
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[0017] 發(fā)明目的：本發(fā)明提供一種快速簡易分離純化降纖酶的方法，其目的是解決以往 的方法所存在的問題。
[0018] 技術方案：本發(fā)明是通過以下技術方案來實現的：
[0019] -種快速簡易分離純化降纖酶的方法，其特征在于：該方法上柱之前，用 10, 000MW膜和50, 000MW膜超濾蛇毒溶液，去除絕大部分雜質，再利用肝素-Sephar〇Se4B柱 的分離純化進行制備。
[0020] 該方法的步驟如下：
[0021](1)、精密稱取白眉蝮蛇毒14-16g，在3 °C~5 °C條件下，用200ml0. 1M Tris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液進行溶解，溶解液在3°C~5°C條件下用12000~13000轉/ 分離心機離心20分鐘，棄掉沉淀物，上清液備用；
[0022] (2)將離心上清液首先用截留分子量50, 000麗的超濾膜進行超濾，將濾液收集 起來，然后把此濾液用截留分子量10, 000MW的超濾膜再進行超濾，這次收集膜上部分，用 0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2 緩沖液定容至 50ml;
[0023] (3)將二次超濾后得到的50ml超濾液緩緩上已經用0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2 緩沖液充分沖洗平衡的肝素-S印harose4B柱，上完樣，用0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2緩 沖液充分洗脫，直至基線平直，然后用〇. 1MTris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液對含1MNaCL的 0. 1MTris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液進行梯度洗脫，洗脫體積為柱體積的5倍，收集活性峰， 進行純度鑒定、脫鹽、濃縮、凍干即可。
[0024]肝素-Sepharose4B柱的制備：
[0025]a、取 100-110gCNBr-activatedS印harose4B膠用ImMHCL(PH2. 0 ~3. 0 ) 溶液充分膨脹，然后用ImMHCL(PH2. 0~3. 0 )溶液進行充分洗滌，lg膠要用大于200ml 以上的該溶液進行洗滌；
[0026] b、精密稱取400-440萬單位肝素，用偶聯緩沖液即含0. 5MNaCL的0. 1MNaHC03 PH8. 3±0. 2的緩沖液進行溶解，1克肝素大約用5毫升偶聯緩沖液；
[0027] c、將含肝素的偶聯緩沖液倒入用IMm HCL(PH2. 0~3. 0)溶液處理過的 CNBr-activated Sepharose4B膠里，在室溫條件下，將此混合物輕輕上下翻轉一個小時；
[0028]d、用偶聯緩沖液充分沖洗剛偶聯肝素的膠，至少沖洗膠體積的5倍以上；
[0029] e、將剛用偶聯緩沖液充分沖洗過的膠轉移到0. 1M Tris-HCL, PH8. 0±0. 2的緩沖 液中，室溫放置2小時；
[0030]f、將e項剛處理完的膠用含0. 5MNaCL的0. 1M醋酸/醋酸鈉PH4. 0±0. 2的緩沖 液和含0. 5MNaCL的0. 1MTris-HCL，PH8. 0±0. 2的緩沖液進行交替洗滌，交替洗滌次數至 少3次以上，每次洗滌緩沖液的量至少是膠體積的5倍以上；將處理好的膠裝在特殊層析柱 里即可使用。
[0031] 優(yōu)點及效果：
[0032] 本發(fā)明提供一種快速簡易分離純化降纖酶的方法，此方法的主要內容如下：通過 二次超濾技術把絕大部分雜質〔包括大分子和小分子雜質〕去掉，然后通過一次親和層析方 法得到完全符合藥典要求的降纖酶。此方法克服了大多數分離提取降纖酶方法的弱點即分 離柱子多、操作繁瑣、時間長。本方法操作簡單、步驟少、純度高、回收率高、節(jié)省時間。
[0033] 和以往的方法比較其回收率、純度明顯提高、分離時間明顯縮短。一般的分離純化 方法回收率80 %~90 %，比活力1200單位~2500單位，HPLC相對百分含量90 %~95 %，需要兩三天時間，而我們的工藝下來的降纖酶比活力大于4000單位而HPLC相對百分含 量大于99 %，回收率則大于95 %，分離時間只需一天。（降纖酶國家標準規(guī)定：比活力不 得少于1200單位，HPLC相對百分含量不得低于90 %。
【具體實施方式】：
[0034] 本發(fā)明提供一種快速簡易分離純化降纖酶的方法，其特征在于：該方法上柱之前， 用10, 000MW膜和50, 000MW膜超濾蛇毒溶液，去除絕大部分雜質，再利用肝素-S印harose4B柱的分離純化方法進行制備。
[0035] 實施例1 :
[0036] 該方法的步驟如下：
[0037] (1)、精密稱取白眉蝮蛇毒14g，在3 °C條件下，用200ml0. 1M Tris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液進行溶解，溶解液在5°C條件下用13000轉/分離心機離心20 分鐘，棄掉沉淀物，上清液備用；
[0038] (2)將離心上清液首先用截留分子量50, 000麗的超濾膜進行超濾，將濾液收集 起來，然后把此濾液用截留分子量10, 000MW的超濾膜再進行超濾，這次收集膜上部分，用 0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2 緩沖液定容至 50ml;
[0039] (3)將二次超濾后得到的50ml超濾液緩緩上已經用0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2 緩沖液充分沖洗平衡的肝素-S印harose4B柱，上完樣，用0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2緩 沖液充分洗脫，直至基線平直，然后用〇. 1MTris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液對含1MNaCL的 0. 1MTris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液進行梯度洗脫，洗脫體積為柱體積的5倍，收集活性峰， 進行純度鑒定、脫鹽、濃縮、凍干即可。
[0040]肝素-Sepharose4B柱的制備：
[0041]a、取 100gCNBr-activatedSepharose4B膠用ImMHCL(PH2. 0 )溶液充分膨 脹，然后用ImMHCL(PH2.0 )溶液進行充分洗滌，lg膠要用大于200ml以上的該溶液進 行洗滌；
[0042]b、精密稱取400萬單位肝素，用偶聯緩沖液即含0. 5MNaCL的0. 1M NaHC03PH8. 3±0. 2的緩沖液進行溶解，1克肝素大約用5毫升偶聯緩沖液；
[0043] c、將含肝素的偶聯緩沖液倒入用IMm HCL(PH2. 0)溶液處理過的 CNBr-activated Sepharose4B膠里，在室溫條件下，將此混合物輕輕上下翻轉一個小時；
[0044]d、用偶聯緩沖液充分沖洗剛偶聯肝素的膠，至少沖洗膠體積的5倍以上；
[0045]e、將剛用偶聯緩沖液充分沖洗過的膠轉移到0. 1MTris-HCL，PH8. 0±0. 2的緩沖 液中，室溫放置2小時；
[0046]f、將e項剛處理完的膠用含0. 5MNaCL的0. 1M醋酸/醋酸鈉PH4. 0±0. 2的緩沖 液和含0. 5MNaCL的0. 1MTris-HCL，PH8. 0±0. 2的緩沖液進行交替洗滌，交替洗滌次數至 少3次以上，每次洗滌緩沖液的量至少是膠體積的5倍以上；將處理好的膠裝在特殊層析柱 里即可使用。
[0047] 實施例2:
[0048] 該方法的步驟如下：
[0049] (1)、精密稱取白眉蝮蛇毒15g，在4 °C條件下，用200ml0. 1M Tris-HCL，PH7. 0±0. 2緩沖液進行溶解，溶解液在4°C條件下用12000轉/分離心機離心20 分鐘，棄掉沉淀物，上清液備用；
[0050] (2)將離心上清液首先用截留分子量50, 000麗的超濾膜進行超濾，將濾液收集 起來，然后把此濾液用截留分子量10, 000MW的超濾膜再進行超濾，這次收集膜上部分，用 0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2 緩沖液定容至 50ml;
[0051] (3)將二次超濾后得到的50ml超濾液緩緩上已經用0. 1MTris-HCL,PH7. 0±0. 2 緩沖液充分沖洗平衡的肝素-S印harose4B柱，上完樣，用0.