同時(shí)鑒別8種感染人不同亞型禽流感病毒HA基因的GeXP快速檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于禽類病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種同時(shí)鑒別8種感染人不同亞型 禽流感病毒HA基因的GeXP快速檢測(cè)引物組、試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒是目前危害人類健康的主要病原微生物之一，不但造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損 失，而且影響著社會(huì)的穩(wěn)定。流感病毒的天然宿主是禽類，而禽流感病毒可以突破種間屏 障去感染人。迄今為止，能感染人類并引起人類流感大流行或季節(jié)性流感的A型流感病毒 僅有H1NUH2N2和H3N2亞型的流感病毒，從溯源上來(lái)說(shuō)，人流感病毒都來(lái)源于禽流感病毒。 近年來(lái)，H5亞型高致病性禽流感在家禽中常有暴發(fā)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并偶爾傳給人 類，在局部地區(qū)引起集中感染或散發(fā)病例。2013年2月，在我國(guó)安徽和上海等地出現(xiàn)了一 種新型的人感染H7N9禽流感病毒，截至2015年2月23日，已經(jīng)造成571例人類感染，并導(dǎo) 致212例死亡。H9N2亞型流感病毒是一種常見于家禽的低致病性的流感病毒。近年來(lái)不斷 有學(xué)者從感染患者樣本中分離出了H9N2亞型流感病毒。早在2004年，埃及就報(bào)道了首例 H10N7亞型禽流感病毒感染人事件，澳大利亞在2010和2012年也先后發(fā)生了H10N7病毒感 染人的病例。2013年12月，我國(guó)江西省出現(xiàn)了首例人感染H10N8禽流感病毒病例，并導(dǎo)致 患者死亡。2013年6月，在我國(guó)臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)了全球首例人類感染H6N1亞型禽流感病毒病例。 從患者體內(nèi)所分離的病毒基因序列顯示該病毒為一典型的低致病性禽流感病毒。上述研究 表明至少有Hl、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10八種感染人不同亞型禽流感病毒存在。
[0003]目前，禽流感病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)主要包括病毒的分離及培養(yǎng)、血清學(xué)試驗(yàn)、分子 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和免疫熒光等方法，且病毒的分離與培養(yǎng)是診斷禽流感病毒感染的"金標(biāo)準(zhǔn)"。 由于禽流感亞型眾多且新的變異株不斷出現(xiàn)，使用上述檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行分型和診斷不僅 存在著操作方法復(fù)雜，而且檢測(cè)周期長(zhǎng)及容易受抗體等因素影響使得檢測(cè)結(jié)果不能準(zhǔn)確和 及時(shí)。雖然多重PCR有著能同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)目的因片段進(jìn)而實(shí)現(xiàn)多種病原體的快速診斷并 降低檢驗(yàn)成本的優(yōu)點(diǎn)，但是普通多重PCR在擴(kuò)增的過(guò)程中容易受到目的基因模板的特性、 引物濃度和比例及PCR所用的試劑之間的相互作用等的影響，進(jìn)而導(dǎo)致樣品擴(kuò)增效率不一 致使得檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性大大降低。GeXP多基因遺傳表達(dá)分析系統(tǒng)的多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈 反應(yīng)（Multiplexreversetranscription-polymerasechainreaction,mRT-PCR)是由通 用引物（上游加熒光標(biāo)記）和特異性嵌合引物（基因特異性引物5'末端連接通用引物序 列）相結(jié)合建立多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)體系，采用通用引物引發(fā)的策略，可以克服普通 多重PCR存在的擴(kuò)增效率不一的問(wèn)題。此外，該方法利用毛細(xì)管電泳進(jìn)行產(chǎn)物的分離，大大 提高了檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和可靠性。
[0004] 目前檢測(cè)不同亞型AIV的核酸檢測(cè)方法至多是同時(shí)針對(duì)三種不同的HA亞型，一個(gè) 反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)HI、H2、H3、H5、H6、H7、H9、和H10八種感染人不同AIVHA亞型的檢測(cè)技術(shù)尚 未見有報(bào)道。
[0005] 公開于該【背景技術(shù)】部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng) 當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明建立的GeXP多重PCR技術(shù)能夠在四個(gè)小時(shí)內(nèi)通 過(guò)一個(gè)PCR反應(yīng)能同時(shí)檢測(cè)M、Hl、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H109個(gè)基因的八種感染人不同 亞型禽流感病毒HA基因多重逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)（mRT-PCR)方法，對(duì)禽流感病毒8種不 同HA亞型進(jìn)行檢測(cè)和分型，達(dá)到快速診斷和鑒別感染人類不同亞型禽流感病毒的目的，對(duì) 可以感染人的禽流感的流行病學(xué)調(diào)查及其防控，保障人類公共衛(wèi)生的安全和健康持續(xù)發(fā) 展具有重要意義。
[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種同時(shí)鑒別8種感染人不同亞型禽流感病毒 HA基因的GeXP快速檢測(cè)引物組、試劑盒及其應(yīng)用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 一種同時(shí)鑒別8種感染人不同亞型禽流感病毒HA基因的GeXP快速檢測(cè)引物組， 包括9對(duì)特異性引物和1對(duì)通用引物；9對(duì)特異性引物分別是引物對(duì)A1和A2、引物對(duì)B1和 B2、引物對(duì)C1和C2、引物對(duì)D1和D2、引物對(duì)E1和E1、引物對(duì)F1和F2、引物對(duì)G1和G2、弓丨 物對(duì)H1和H2、引物對(duì)II和12 ;1對(duì)通用引物為Cy5-Tag-F和Tag-R;其分別具有如SEQID No. 1至SEQIDNo. 20所示的序列。
[0010] 一種同時(shí)鑒別8種感染人不同亞型禽流感病毒HA基因的GeXP快速檢測(cè)試劑盒， 包括cDNA、10XPCRbuffer、MgCl2、dNTP、JumpstartTaqpolymerase、9 對(duì)特異性引物、1 對(duì)通用引物和RNA-free7K，所述的9對(duì)特異性引物、1對(duì)通用引物分別具有如SEQIDNo. 1 至SEQIDNo. 20所示的序列。
[0011] 作為優(yōu)選，所述的9對(duì)特異性引物A1和A2、引物對(duì)B1和B2、引物對(duì)Cl和C2、弓丨 物對(duì)D1和D2、引物對(duì)E1和E2、引物對(duì)F1和F2、引物對(duì)G1和G2在PCR反應(yīng)體系中對(duì)應(yīng)的 的摩爾濃度分別為 150nmol/L、100nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、100nmol/L、100nmol/L、 100nmol/L、100nmol/L、lOOnmol/L;所述的通用引物Cy5-Tag-F、Tag-R在PCR反應(yīng)體系中的 摩爾濃度為500nmol/L。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的試劑盒的總體積為25μ!7管，其中包含：cDNA2. 0yL，10XPCR buffer2.5μL，MgCl22. 5μL，dNTP1μL，JumpstartTaqpolymerase1.2μL，9 對(duì)特異性 引物混合物1. 25yL，上、下游通用引物混合物1. 25yL，RNA-free水補(bǔ)足至25yL。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述的同時(shí)鑒別8種感染人不同亞型禽流感病毒HA基因的GeXP 快速檢測(cè)引物組或所述的同時(shí)鑒別8種感染人不同亞型禽流感病毒HA基因的GeXP快速檢 測(cè)試劑盒在鑒別Hl、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H10亞型禽流感病毒中的應(yīng)用。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0015] 1.本發(fā)明利用GenomeLab(tm)GeXP遺傳分析系統(tǒng)建立了一種能同時(shí)檢測(cè)M、H1、 H2、H3、H5、H6、H7、H9和H109個(gè)基因的八種感染人不同亞型禽流感病毒HA基因多重逆轉(zhuǎn) 錄一聚合酶鏈反應(yīng)（mRT-PCR)方法。首先對(duì)反應(yīng)條件和多重反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，然后分別 用已驗(yàn)證的陽(yáng)性模板對(duì)多重PCR體系進(jìn)行特異性驗(yàn)證。多重檢測(cè)體系可以同時(shí)檢測(cè)出八種 感染人不同亞型禽流感病毒，靈敏度為1〇 2拷貝/yL。該方法具有高通量、特異性強(qiáng)、靈敏 度高且快速等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)感染人不同亞型禽流感病毒的流行病學(xué)調(diào)查及其鑒別診斷具有重要 意義。
[0016] 2.本發(fā)明建立的GeXP多重PCR技術(shù)能夠在四個(gè)小時(shí)內(nèi)通過(guò)一個(gè)PCR反應(yīng)能同時(shí) 檢測(cè)M、Hl、H2、H3、H5、H6、H7、H9和H109個(gè)基因的八種感染人不同亞型禽流感病毒HA基 因多重逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)（mRT-PCR)方法，對(duì)禽流感病毒8種不同HA亞型進(jìn)行檢測(cè)和 分型，達(dá)到快速診斷和鑒別感染人類不同亞型禽流感病毒的目的，對(duì)可以感染人的禽流感 的流行病學(xué)調(diào)查及其防控，保障人類公共衛(wèi)生的安全和健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為GeXP多重PCR的毛細(xì)管電泳分析圖；
[0018] 圖2為對(duì)臨床單一感染H6亞型禽流感病毒的檢測(cè)結(jié)果；
[0019] 圖3為對(duì)臨床單一感染H9亞型禽流感病毒的檢測(cè)結(jié)果；
[0020] 圖4對(duì)臨床單一感染H2亞型禽流感病毒的檢測(cè)結(jié)果；
[0021] 有關(guān)附圖標(biāo)記的說(shuō)明：
[0022] 橫坐標(biāo)-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基數(shù)；縱坐標(biāo)-熒光信號(hào)值。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不 局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此 外，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種修改，這些等價(jià)變化同 樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0024] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所 使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例中所使用的禽流感毒株 及其他禽類病毒參考株均由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所保存。
[0025] 實(shí)施例1:倉(cāng)流感病毒多重RT-PCR引物設(shè)計(jì)
[0026] 參考相關(guān)文獻(xiàn)從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載禽流感病毒M、Hl、H2、H3、H5、H6、H7、 H9和H109個(gè)基因的序列，利用DNAStar分別對(duì)各個(gè)基因核苷酸序列進(jìn)行分析和比較，尋 找出適合設(shè)計(jì)特異性引物的保守區(qū)域，利用GeXPexpressprofiler工具設(shè)計(jì)針對(duì)禽流 感病毒9對(duì)基因的特異性引物（見表1)，設(shè)計(jì)好的引物采用PrimerPremier5. 0、NCBI PrimerBlast和01igo7. 0進(jìn)行分析和篩選，然后在全部正向引物和反向引物的5'端分別加 入一段非同源性獨(dú)特序列作為通用引物（Uni-Primer)，上游通用引物5'端標(biāo)記熒光染料 Cy5,即Cy5_Tag_F，由上海Invitrogen公司合成，HPLC純化。
[0027] 表1引物信息
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